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Artículo recibido 31 de julio de 2023
Publicado 25 de septiembre de 2023
Emulsiones agua/agua gelificadas como posibles encapsulantes de
antioxidantes naturales
Sanchez, María F.1,2; Ingrassia, Romina N.2,3; Risso, Patricia H.2,3
1Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Rosario (UNR); 2CONICET;
3Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR
Patricia Risso: 0000-0002-2700-287X
María Florencia Sanchez: 0009-0005-8382-3954
Romina Ingrassia: 0000-0001-6584-8051
Resumen
El objetivo de este trabajo fue evaluar las propiedades tecnofuncionales de geles ácidos
de mezclas caseinato de sodio (NaCAS) y goma tara (GT), en ausencia y en presencia
de extracto proteico de espirulina (EPE), como evaluación previa de la posible
microencapsulación de EPE en microgeles de NaCAS. En el rango de concentraciones
de NaCAS y GT evaluados se observó la formación de microgeles esféricos, pero no se
obtuvieron en presencia de EPE hasta 3%.
Palabras clave: caseinato de sodio, goma tara, espirulina, ficocianina C, microgeles
Abstract
Gelled water/water emulsions as possible encapsulants of natural antioxidants
This work aimed the techno-functional properties of acid gels of sodium caseinate
(NaCAS) and tara gum (GT) mixtures, in the absence and the presence of spirulina
protein extract (EPE), as a preliminary evaluation of the possible microencapsulation of
EPE in NaCAS microgels. The formation of spherical microgels was observed in the
range of NaCAS and GT concentrations evaluated, but they were not obtained in the
presence of EPE up to 3%.
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Keywords: sodium caseinate, tara gum, spirulina, phycocyanin, microgels
INTRODUCCIÓN
El interés de los consumidores por productos alimenticios que promuevan
beneficios para la salud ha provocado un incremento en la formulación y
comercialización de alimentos denominados “funcionales” y “nutracéuticos”. Por otra
parte, el comercio de los bienes agroindustriales dentro del nuevo paradigma
internacional involucra un intercambio de productos con mayor grado de elaboración
y/o valor. En particular, la extracción y purificación de compuestos bioactivos a partir
de fuentes naturales, ha tenido un gran crecimiento debido al uso de estos fitoquímicos
en la preparación de suplementos dietarios (nutracéuticos) y alimentos funcionales [1].
Las algas microscópicas han demostrado ser una fuente potencial para el
enriquecimiento de alimentos debido a que presentan en su composición valiosas
sustancias bioactivas [2]. La espirulina (ESP) posee un elevado contenido proteico (60-
70% en base seca), con todos los aminoácidos esenciales y siendo la ficocianina C
(FCC) la proteína mayoritaria [3]. La FCC se caracteriza por su color azul y capacidad
antioxidante que contribuiría a prevenir el desarrollo de enfermedades originadas por
estrés oxidativo [4]. Esta proteína es inestable frente a variaciones de pH, temperatura y
luz, por lo tanto, se degradan en el extracto durante su almacenamiento o procesamiento
industrial, observándose cambios de color y pérdida de su capacidad antioxidante [5,6].
Una forma de aumentar la estabilidad de la FCC es a través de su
encapsulación en matrices biopoliméricas. La microencapsulación retarda las reacciones
químicas con el medio que lo rodea promoviendo un aumento en la vida útil del
producto, la liberación gradual del compuesto encapsulado e incluso facilita su
manipulación [7]. Se han propuesto diversas técnicas de microencapsulación y diversos
materiales de pared [8]. Esquena (2016) planteó la posibilidad del uso de emulsiones
agua/agua (W/W) como plantillas para la formación de microgeles que pueden utilizarse
para encapsular compuestos bioactivos hidrofílicos [9]. Las emulsiones W/W pueden
formarse debido a la incompatibilidad termodinámica entre soluciones acuosas de
ciertas combinaciones de polímeros hidrofílicos y pueden estabilizarse por la realización
simultánea de procesos de separación de fases segregativa y gelación ácida, obteniendo
dispersiones coloidales de microgeles [10]. El objetivo del trabajo fue evaluar las
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propiedades tecnofuncionales de geles ácidos de mezclas NaCAS/GT, en ausencia y en
presencia de EPE, como evaluación preliminar de la posible microencapsulación de
EPE en microgeles de NaCAS.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Se utilizó caseinato de sodio bovino (NaCAS), tris(hidroximetil)aminometano
(Tris) y glucono--lactona (GDL) de Sigma-Aldrich Co. (Steinheim, Alemania), goma
tara (GT) de G y G Suministros (Rosario, Argentina); CaCl2, HCl y Rodamina B de
Ciccarelli SRL (San Lorenzo, Argentina) y espirulina (ESP) en polvo provista por la
empresa Hydro Farming S. A. (Coronel Bogado, Argentina).
Extracción y caracterización del EPE
Se realizaron dispersiones al 10% de la ESP en solución acuosa de CaCl2 1,5%
con agitación magnética durante 7,5 h y posterior centrifugación a 930xg durante 20
min y a 25°C. Se realizó la cuantificación de la FCC en el sobrenadante obtenido por
espectroscopía en el rango visible, utilizando un espectrofotómetro Jasco V-550
(Tokyo, Japan). Se realizaron espectros de absorción utilizando diferentes diluciones del
extracto.
La concentración de FCC en mg/mL (CFCC) se calculó como:
(1)
siendo Abs615 y Abs652 las absorbancias a 615 y 652 nm, respectivamente. Luego, se
calculó la concentración de FCC en mg/g ESP seca.
Además, se realizaron espectros de emisión de fluorescencia para evaluar el
estado conformacional de la FCC, excitando a 609 nm, en un espectrofluorómetro
Aminco Bowman Serie 2 (Massachusetts, USA). Se realizaron espectros de emisión
utilizando diferentes diluciones del extracto.
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Para evaluar la capacidad antioxidante del EPE se realizó el método de captura
del radical ácido 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiasolina-6-ácido sulfónico) (ABTS+),
determinando la disminución de la absorbancia a 730 nm del radical en presencia del
extracto [11]. La capacidad antioxidante se expresó como la equivalente a la
concentración de Trolox (M), usado como estándar de referencia.
Preparación de las soluciones
Las concentraciones fueron expresadas como porcentaje P/P (g de
compuesto/100 g de solvente). Las soluciones madre de NaCAS y GT se prepararon al
8% y al 1%, respectivamente, en agua destilada o en buffer Tris-HCl 10 mM, pH 7
(BT).
Compatibilidad termodinámica
La compatibilidad termodinámica de las mezclas de proteínas (NaCAS y EPE)
y polisacárido (GT) se determinó mediante el método descripto por Spyropoulus y col.
(2010) [12]. Los sistemas binarios y ternarios se prepararon utilizando una
concentración constante de NaCAS en BT (3%), utilizando en un caso la misma
concentración de GT pero variando la concentración de EPE en un rango de 0,0-3,0 %
y, en otro caso, usando la misma concentración de EPE y variando la de GT (0,0-0,3
%). Los sistemas se mezclaron en vórtex durante 10 s, luego se incubaron por 24 y 48 h
a 37°C en baño termostático y luego se realizó una inspección visual.
Preparación de geles ácidos y evaluación de sus parámetros reológicos y texturales,
capacidad de retención de agua (CRA) y microestructura
Los geles se prepararon a 37 °C por adición de GDL a las dispersiones en una
relación de R de 0,5 siendo R el cociente entre la concentración (%) de GDL y la
concentración (%) de NaCAS. Se realizaron medidas de la viscosidad de las
dispersiones en un viscosímetro biko-visc premium de BYK Instruments (Berlín,
Alemania). Para las mediciones, se colocaron muestras de 50 g en un vaso de
precipitados y se utilizó una geometría con un radio de 1,5 cm y a una velocidad de 100
rpm. Se registraron los valores de viscosidad a lo largo del tiempo (t) hasta la
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gelificación de los sistemas, determinada por el aumento brusco de la viscosidad,
obteniéndose el tiempo de formación del gel (tgel).
La CRA se determinó como:
(2)
Se colocaron 10 gramos de muestra en tubos de Khan, se adicionó GDL y se
dejó en reposo durante 120 min en baño termostático a 37°C. Una vez gelificadas las
muestras, se centrifugaron a 930xg y se descartó el suero expelido.
Para evaluar la textura de los geles se realizaron análisis de doble compresión
en un texturómetro Perten TVT 6700 (Suecia) acoplado a un dinamómetro digital (celda
de carga de 10 N) con una geometría cilíndrica de 2 cm de diámetro, a una velocidad
constante de 1 mm/s y con penetración a una distancia de 25 mm. Las muestras (20 g)
fueron colocadas en cilindros de 3 cm de diámetro de sección y 3 cm de altura.
La dispersión acuosa del NaCAS, con y sin GT (0,2%) se tiñó con solución de
rodamina B (2 mg/L). Para iniciar la gelación ácida, se añadió GDL en relación R=0,5,
se colocaron alícuotas de 200 L placas LAB-TEK II y se incubaron a 37°C. Una vez
formados, los geles fueron observados en un microscopio confocal de barrido invertido
NIKON Eclipse TE-2000-E (Nikon Instruments Inc., Japón), con objetivo 20×, zoom
4×, láser He-Ne con excitación a 543 nm y banda de emisión 605-675 nm. Las
imágenes se almacenaron en formato TIFF. También se obtuvieron imágenes en
presencia de EPE con y sin rodamina B y de suspensiones acuosas de EPE.
Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como valor medio ± desvío estándar de al menos
tres determinaciones independentes. El análisis estadístico fue realizado mediante
análisis de la variancia (ANOVA). Se consideraron a las diferencias significativas
cuando p<0,05.
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RESULTADOS
Caracterización del EPE extraído y evaluación de la compatibilidad termodinámica
La concentración de FCC fue (100 ± 10) g FCC/g ESP. Los espectros de
fluorescencia revelaron un pico de emisión máxima a 639 nm. La capacidad
antioxidante fue equivalente a (49 ± 8) M de Trolox.
En la Figura 1 se muestra el diagrama de fases binario (EPE o GT 0%) y
ternario a una concentración constante de NaCAS (3%) observado a las 24 y 48 h,
donde los símbolos representan una solución monofásica límpida (○) o un sistema
Figura 1. Diagrama de fases de mezclas binarias y ternarias de NaCAS (3%), GT (0-0,3%) y
EPE (0-3%) en buffer BT, luego de 24 y 48 h a 37 °C.
bifásico (●).
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En ausencia de EPE, se observa separación de fases a partir de 0,2% de GT, ya
reportado por Hidalgo y col. [13]. A pH 7, el NaCAS y el EPE poseen carga neta
negativa mientras que la GT no posee carga, por lo cual se trata de una separación de
fases segregativa, en la que cada biopolímero se reparte en mayor proporción en una de
las fases. En ausencia de GT, hay separación de fases segregativa entre NaCAS y el
EPE a partir de una concentración de este último de 0,5%. En presencia de GT y EPE,
sólo se observó separación de fases para GT 0,2% y EPE ≥ 1%. La presencia de GT
modifica el rango de concentraciones de EPE en la cual el NaCAS 3% es co-soluble con
este.
Evaluación de parámetros reológicos y texturales, capacidad de retención de agua
(CRA) y microestructura de los geles ácidos mixtos
A concentraciones de GT ≥ 0,2% y/o de DPE ≥ 0,3%, el tgel fue
significativamente mayor (p<0,001) y la viscosidad final alcanzada menor (p=0,013),
asumiendo valores de 50±3 min y de 0,5±0,2 P, respectivamente. En comparación, los
geles mixtos de otra composición presentaron tgel de 39±5 min y viscosidad final de
0,9±0,2 P. Los geles, en general, son débiles, pero los geles con GT ≥ 0,2% y/o DPE 3%
presentaron menor dureza (p<0,001), con rango de valores de 0,07-0,15 N, que el resto
(0,32-0,53 N). Para la elasticidad, vinculada con la capacidad de recuperación de la
muestra entre el final de la primera compresión y el inicio de la segunda, no se
observaron diferencias significativas (p=0,929), con valores de 0,78-1,11. La
cohesividad representa el punto límite hasta el cual puede deformarse el material antes
de romperse, vinculado a la fuerza con la que están unidas las partículas. Los geles sin
GT tuvieron menor cohesividad (0,54-0,77) independientemente de la concentración de
DPE (p<0,001), mientras que en presencia de GT hubo una mayor interacción entre
partículas (0,82-0,96). Además, los geles sin GT tuvieron mayor masticabilidad (28±16
J) y gomosidad (270±40 mN) (p<0,001), en comparación con el resto de los geles con
masticabilidad de 9±4 J y gomosidad de 66±9 mN. La primera es una medida de la
energía y la segunda de la fuerza requeridas para desintegrar el gel hasta que se pueda
tragar.
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En la Figura 2 se muestran imágenes obtenidas de una suspensión de EPE 10%
en agua destilada con (A) y sin (B) Rodamina B, marcador fluorescente que tiñe de rojo
a las proteínas. Por otra parte, la FCC en los EPE tiene autofluorescencia.
Figura 2. Imágenes digitales de microscopía confocal de EPE 10% en agua destilada,
con (A) y sin (B) Rodamina B
En la Figura 2A se observan todas las proteínas presentes en el extracto,
mientras que en la 2B sólo se observa a la FCC. En la Figura 3 se muestran imágenes
digitales de geles
Figura 3. Imágenes digitales de microscopía confocal de geles de NaCAS 3% (A), de NaCAS
3% y GT 0,2% (B), de NaCAS 3%, GT 0,2% y EPE 0,3% y de NaCAS 3% y EPE 3%.
ácidos de algunas de las mezclas del diagrama de fases de la Figura 1. Las proteínas
están teñidas de rojo, mientras que las zonas negras corresponden a la fase rica en GT.
En la Figura 3A se observa la red proteica compacta de NaCAS,
correspondiente con una procedencia de mezcla monofásica, lo que explica valores
mayores de viscosidad (1,2±0,2 P), dureza (0,53±0,02 N), masticabilidad (30±5 J) y
gomosidad (295±5 mN) y menores valores de cohesividad (0,57±0,02). En la Figura 3B
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se muestra la formación de microgeles esféricos de NaCAS (3%) en presencia de GT
0,2% con un diámetro medio de 2-4 m. Esto se corresponde con su procedencia de un
sistema bifásico y con la mayor cohesividad (0,83±0,04), debida a la interacción
NaCAS-NaCAS durante la formación de las microesferas de gel, y menor viscosidad
(0,7±0,2 P), dureza (0,075±0,005 N), masticabilidad (6,7±0,6 J) y gomosidad (67±6
mN). Pero en presencia de EPE 0,3%, la microestructura cambia a una malla de gel con
poros más grandes, gel formado a partir de un sistema monofásico y que presenta
viscosidad de 0,6±0,2 P. Además, hay diferencias significativas de la dureza (p=0,011),
cohesividad (p<0,001), masticabilidad (p=0,003) y gomosidad (p<0,001) con respecto
al gel de NaCAS, pero no con respecto a la muestra de NaCAS y GT. Los valores
obtenidos fueron 0,088±0,001 N, 0,82±0,04, 7±1 J y 72±6 mN para dureza,
cohesividad, masticabilidad y gomosidad, respectivamente. La Figura 3D corresponde a
un gel ácido de NaCAS y EPE, ambos al 3%, en ausencia de GT, y que proviene de una
mezcla bifásica como se observa en la Figura 1. Se pueden observar estructuras de
diversos tamaños y formas, que se diferencian en la Figura 4 como restos de ESP
(células rojas) y agregados de ficobiliproteínas en azul y magenta, pero no se observan
microgeles de NaCAS a esta relación de concentraciones. Estos geles también
presentaron valores de dureza, significativamente diferentes de los geles de NaCAS
(p=0,001), con valores de 0,085±0,001 N, masticabilidad de 5,7±0,6 J y gomosidad de
58,8±0,01 mN, respectivamente. Sin embargo, la cohesividad resultó mayor (p=0,021)
con valores de 0,70±0,06 pero menor que en presencia de GT (p=0,038). Esto indica
interacciones entre las partículas proteicas, pero de menor magnitud que en presencia de
GT.
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En conclusión, la microestructura y características de los geles variaron según
la compatibilidad termodinámica de los biopolímeros. En el rango de concentraciones
de NaCAS y GT evaluados se observó la formación de microgeles esféricos, pero no se
obtuvieron en presencia de EPE hasta 3%. La presencia de células de ESP en los geles
indica que es necesario optimizar el método de extracción de los EPE para obtener un
mayor grado de pureza en FCC.
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Figura 4. Imágenes digitales de microscopía confocal de gel de NaCAS 3% y EPE 3%.
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