1
Artículo recibido 4 de agosto de 2023
Publicado 25 de septiembre de 2023
Efecto de adición de azúcares y presencia de oxigeno sobre el
metabolismo de bacterias lácticas: soja y medio de cultivo
Rodríguez de Olmos, Antonieta
1
; Nacchio, Bárbara L.
2
; Garro, Oscar A.
3
; Garro, Marisa
S.
2
1-Universidad Católica de Salta (UCASAL), Salta, Argentina
E-mail: anttorod@gmail.com
2-Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA)-CONICET-CCT NOA Sur, Chacabuco
145, (T4000ILC) San Miguel de Tucumán, Tucumán, Argentina.
E-mail: blnacchio@gmail.com; mgarro@cerela.org.ar
3- Universidad Nacional del Chaco Austral (UNCAUS)-INIPTA-CONICET
Cte. Fernandez 755 (3700)- Pcia. Roque Saenz Peña, Chaco, Argentina
E-mail: garro@uncaus.edu.ar
ORCID Antonieta Rodríguez de Olmos 0000-0002-0722-4141
ORCID Luciana Bárbara Nacchio 0009-0007-3665-286X
ORCID Oscar Garro 0000-0003-4106-2315
ORCID Marisa Selva Garro 0000-0003-4496-4584
Resumen
Estudios en pastas de soja (PS) sin adición de azúcar y baja concentración de humedad,
mostraron que Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei CRL 207 produjo
principalmente ácido acético y en menor proporción, ácido láctico y etanol, presentando
un cambio en su vía metabólica normal. La cepa no utilizó los principales hidratos de
carbono presentes por lo que se podría generar una condición de sustrato limitante con
cambios en el uso del piruvato. El oxígeno es un factor importante en el metabolismo y
destinos del piruvato, y se encuentra presente en sustratos sólidos principalmente en
aquellos que contienen menor contenido de agua. En este trabajo se estudió el
2
crecimiento, consumo de sustrato y producción de ácidos orgánicos por la cepa en PS
con 65% de humedad adicionadas con sacarosa, glucosa o fructosa, usando como
control la PS basal. Además, se realizaron estudios en medio líquido adicionado con los
mismos azúcares, en agitación para evaluar la influencia del oxígeno. Los resultados
obtenidos demostraron un cambio en el metabolismo de la cepa bajo las condiciones
estudiadas (diferentes fuentes de carbono y disponibilidad de oxígeno) por la baja
humedad del sustrato sólido de soja.
Palabras clave: Bacterias lácticas, soja, fermentación en sustrato sólido, oxigeno,
fuentes de carbono
Abstract
Effect of sugar addition and oxygen presence on the metabolism of lactic acid bacteria:
soybean and culture medium
Studies in soybean pastes (PS) without added sugar and low moisture concentration,
showed that Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei CRL 207 produced mainly
acetic acid and, to a lesser extent, lactic acid and ethanol, presenting a change in its
normal metabolic pathway. The strain did not use the main carbohydrates present, so a
limiting substrate condition could be generated with changes in the use of pyruvate.
Oxygen is an important factor in the metabolism and fate of pyruvate and it is present in
solid substrates, mainly those with lower water content. In order to understand the
behavior presented by the strain in the PS, in this work we studied the growth,
consumption of substrate and production of organic acids by the strain in PS with 65%
moisture added with sucrose, glucose or fructose, using basal PS as control. In addition,
studies were carried out in a liquid medium added with the same sugars, under agitation
to evaluate the influence of oxygen. The results obtained demonstrated a change in the
metabolism of the strain under the studied conditions (different carbon sources and
oxygen availability) due to the low moisture of the solid soybean substrate.
Keywords: Lactic acid bacteria, soy bean, solid state fermentation, oxygen, carbon
source
3
INTRODUCCIÓN
Las bacterias lácticas (BAL) no poseen un sistema respiratorio funcional por lo
que deben obtener su energía a través de la fosforilación a nivel de sustrato. Los
azúcares son la principal fuente de carbono y de energía para las BAL tanto para la
producción de alimentos fermentados, como en los medios utilizados a escala
laboratorio. Si bien las BAL prefieren la glucosa como fuente de carbono y energía,
tienen la capacidad de metabolizar otras hexosas comunes; siendo un comportamiento
dependiente de cepa. Las BAL asociadas a vegetales utilizan una gran variedad de
hidratos de carbono, incluyendo los beta-glucósidos [1]. De acuerdo a las vías de
degradación de azúcares que utilizan, las BAL se dividen en homofermentativas y
heterofermentativas. Las bacterias homofermentativas utilizan la vía de Embden-
Meyerhof-Parnas (EMP) o glucólisis, para la fermentación de las hexosas, siendo el
ácido láctico el principal producto de fermentación [2], [3]. En este metabolismo el
piruvato es el intermediario clave en la vía para la producción de ácido láctico. Las
bacterias homofermentativas pueden sufrir un cambio metabólico hacia una
fermentación ácido-mixta cuando el flujo glicolítico es bajo, afectando los niveles de los
intermediarios y posteriormente, las actividades de las enzimas que compiten por el
piruvato, dando lugar a otros productos además de lactato, como acetato, formiato y
etanol [2], [4]. Mientras que, las BAL heterofermentativas como Leuconostoc,
Oenococcus, y ciertas especies de Lactobacillus en general no sólo fermentan las
hexosas, sino también las pentosas a través de la vía 6-fosfogluconato-fosfocetolasa
(PK), o vía de las pentosas fosfato, que permite la síntesis de otros productos además de
ácido láctico como etanol, ácido acético y CO
2
[5], [6] [3]. Además, existen otros
caminos alternativos en las BAL para el uso del piruvato que pueden conducir a la
producción de distintos compuestos además de ácido láctico, los cuales pueden ser los
principales metabolitos en condiciones limitantes de glucosa o en presencia de oxígeno
como aceptor de electrones [7].
En condiciones de sustrato limitante o por la naturaleza del sustrato, las células
responden regulando ciertas actividades enzimáticas para impedir parcialmente que el
piruvato se reduzca a ácido láctico. En su lugar, se puede obtener energía utilizando
4
otras alternativas como la piruvato formato liasa o piruvato oxidasa, ya que existe un
sitio de fosforilación a nivel de sustrato que implica la conversión de acetil-P por la
enzima acetato quinasa dando lugar a la producción y acumulación de ácido acético y
ganancia de ATP [5], [8].
La fermentación en sustrato sólido (FSS) es una metodología que se emplea
desde tiempos remotos para la producción de diferentes tipos de productos como
alimentos, medicamentos, compuestos de aroma, etc. [9]. Sin embargo, el estudio de las
bacterias en este tipo de sistemas es escaso y existe poca información sobre la
optimización de parámetros debido a que esta clase de fermentación ha sido utilizada
principalmente en hongos y levaduras por su mayor tolerancia a menores contenidos de
humedad [10], [11].
En trabajos previos se estudiaron los principales parámetros de fermentación de
Lacticaseibacillus (L). paracasei subsp. paracasei CRL 207 sobre pasta de soja (PS) sin
azúcar añadido y varias condiciones de temperatura y humedad [12].
Bajo condiciones de FSS con matriz soja se demostró que la cepa creció y su
biomasa fue similar en todas las condiciones probadas, el pH tuvo poca reducción en PS
con bajo contenido de humedad (65%, 55% y 50%) con respecto al control de PS sin
inocular. El cambio de humedad afecta la transferencia de oxígeno en la FSS y podría
tener un efecto en el uso del piruvato por parte de las BAL. En relación con estos
resultados, en este trabajo se propone analizar el efecto de la adición de diferentes
azúcares en matriz de soja sobre la producción de ácidos orgánicos por L. paracasei
subsp. paracasei. Como estudio complementario se investigó el efecto de la adición
azúcar y la presencia de oxígeno usando medio de cultivo (MRS) y el mismo
microorganismo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Microorganismos y condiciones de cultivo
L. paracasei subsp. paracasei CRL 207 (L. paracasei), perteneciente a la
Colección de cultivos (CRL) de CERELA-CONICET, se utilizó en todos los ensayos.
Previo a su uso se activó y propagó en caldo MRS. Viabilidad celular se determinó por
el método de recuento en placa usando diluciones seriales, los resultados fueron
expresados como log UFC/g o ml. Se utilizaron dos tipos de fermentaciones: liquida en
5
caldo MRS base (sin azúcar), y sustrato sólido (FSS) usando PS con 65% de humedad
[12]. En los diferentes ensayos se adicionó glucosa, fructosa o sacarosa (Britania).
Efecto de la adición de azúcar
Con el objeto de seleccionar la concentración inicial de azúcar a adicionar se
realizó un ensayo preliminar. Se usó MRS base agregando glucosa, fructosa o sacarosa
en diferente concentración: 0,5; 1; 2; 4 y 6% (p/v), se inoculo la cepa seleccionada
(DO
560
inicial de 0,1) en cada condición, y se colocó en microplaca. Se utilizó un lector
de microplacas que permite medir el crecimiento microbiano por densidad óptica
(DO
560
) a 37 °C cada 30 min durante 24 h (VERSAmax, Sunnyvale, CA, EEUU).
Luego, se investigó el agregado de estos azúcares (concentración seleccionada
por ensayo anterior) al medio MRS base en condiciones estáticas y con agitación (150
rpm). Los medios se inocularon con la cepa seleccionada (DO
560
inicial de 0,1) y se
incubaron a 37 °C durante 24 h, tomándose muestras a diferentes tiempos (0, 2, 3, 4, 6,
8 y 24 h). El crecimiento se estudió mediante medidas de absorbancia a 560 nm (Lector
Tubos Spectronic 20, Bausch & Lomb) y medidas de pH. Se calculó la diferencia de
DO y pH (0 y 24h), y la velocidad específica de crecimiento.
Al mismo tiempo, se evaluó la adición de sacarosa y sus productos de hidrólisis
(glucosa y fructosa) en PS. Se inoculó al 2% y se incubo a 37 ºC. Se tomaron muestras
en diferentes tiempos de fermentación (0, 4, 8, 12 y 24 h) y se determinó pH (pHmetro
Sartorius, PT10), ácidos orgánicos y azúcares por técnicas de HPLC [13].
RESULTADOS Y DISCUSION
Selección de la concentración inicial de azúcar en medio de cultivo
En Figura 1 se muestran las curvas de crecimiento en microplaca (DO
560
) de L.
paracasei en caldo MRS base con glucosa (Figura 1A), fructosa (Figura 1B) y sacarosa
(Figura 1C) en diferentes concentraciones. La cepa fue capaz de crecer en todas las
condiciones. En glucosa y fructosa mostró un mayor desarrollo (DO
560
~ 1,4-1,2) en
contraste con las condiciones de sacarosa (DO
560
~ 0,6). En el estudio realizado en MRS
6
se pudo observar que la cepa no fue capaz de utilizar la sacarosa de manera eficiente
como sus monómeros, glucosa y fructosa, presentando un crecimiento menor. Este
crecimiento fue similar con el desarrollo de la cepa en el medio basal sin azúcar (datos
no mostrados), lo que significa que la cepa podría crecer utilizando otra fuente de
carbono y energía, pero en menor medida con respecto a la presencia de azúcares
fermentables como la glucosa y la fructosa. Para todas las condiciones probadas la cepa
creció mejor en 2 % de azúcar añadida, como se puede observar en Figura 1D.
Seleccionando esta concentración (2%) para los ensayos en MRS base con y sin
agitación y en PS.
Crecimiento de L. paracasei en medio MRS base con adición de 2% de azucares en
condiciones estáticas y de agitación
Se evaluó el desarrollo de la cepa en medio líquido con adición de diferentes
azúcares (2%) con y sin agitación para analizar los cambios en presencia de oxígeno
(aerobiosis) ya que este es un factor importante en la FSS [14].
7
Figura 1. Curvas de crecimiento en microplaca (DO
560
) de L. paracasei en caldo MRS base con
diferentes concentraciones de azúcares. A: glucosa; B: fructosa; C: sacarosa; D: crecimiento en
caldo MRS agregado con 2% de cada azúcar.
En la Tabla 1 se muestran los parámetros de crecimiento de la cepa en
condiciones estáticas y en agitación. La presencia de oxígeno por proceso de agitación
produjo un aumento de los valores de biomasa y pH en todas las condiciones en
comparación con el proceso estático. La velocidad específica (μ), el Δlog UFC/ml y el
pH mostraron un ligero incremento, demostrando un efecto positivo por presencia de
oxígeno en los parámetros de crecimiento de esta cepa.
Tabla 1. Parámetros de crecimiento de L. paracasei en MRS base adicionado de 2% de glucosa,
fuctosa o sacarosa en condiciones estáticas y aeróbicas
Estatico
µmax (h
-1
)
ΔDO
560nm
ΔpH
MRS Glucosa 2%
0,48
5,25
2,77
MRS Fructosa 2%
0,47
3,52
2,75
MRS Sacarosa 2%
0,10
0,66
1,11
Con Agitación
MRS Glucosa 2%
0,51
5,58
2,63
MRS Fructosa 2%
0,52
4,60
2,60
MRS Sacarosa 2%
0,13
0,89
0,48
Efecto de la adición de azúcares (sacarosa, glucosa o fructosa) a la pasta de soja
sobre el crecimiento, pH y producción de ácidos orgánicos por L. paracasei
En Figura 2 se muestra el comportamiento de L. paracasei en la PS basal (sin
azúcar adicional), y en las PS adicionadas con 2% de los distintos azúcares (sacarosa,
glucosa y fructosa). En las cuatro condiciones ensayadas la cepa presentó buen
desarrollo alcanzando valores entre 9,75±0,34 y 10,14±0,38 log UFC/g a las 24 h de
fermentación, mostrando el mayor valor para la PS adicionada de glucosa. Se observó
descenso del pH hasta las 8 h, luego de ese tiempo en PS basal y PS con sacarosa el pH
incrementó levemente. Este efecto, podría estar relacionado a la producción de
amoníaco proveniente del catabolismo de aminoácidos por presencia de enzimas
proteolíticas [15]. Los pH finales de fermentación (24 h) tuvieron un comportamiento
diferente que no se correlacionó con la producción de biomasa. En las PS sin adición de
azúcar y con sacarosa no tuvieron tanta acidificación (pH 5,92±0,60 y 5,40±0,17
8
respectivamente), mientras que las PS adicionadas con glucosa o fructosa la
acidificación fue mayor (pH ~ 4,50±0,06) a las 24 h. Por otra parte, los diferentes
valores de pH alcanzados en las muestras podrían estar relacionados con la capacidad de
la cepa para metabolizar cada azúcar en la matriz compleja soja en condiciones de FSS.
En la PS basal la sacarosa presente no mostró variaciones, la cepa no fue capaz de
utilizarla como fuente de carbono, sin embargo se observó formación de ácido acético
(133,27 μmol/g a las 24h) como principal producto de fermentación, mientras que la
producción de ácido láctico fue menor con un valor de 33,03 μmol/g (Figura 2A). En la
PS adicionada de sacarosa (133,41 μmol/g) se observó una disminución del contenido
de este azúcar en las primeras horas de fermentación, manteniéndose luego sin cambios
hasta el final de la misma. La glucosa presente en la pasta (31,90 μmol/g) fue
consumida completamente por la cepa. El ácido láctico fue el principal producto de
fermentación con valores próximos a 150 μmol/g antes de las 24 h, sin embargo, se
observó una disminución del mismo con un valor final de 95,82±10,86 μmol/g.
Además, la cepa también produjo ácido acético incrementado su valor (115,76±17,63
μmol/g) al final de la fermentación (Figura 2B).
Este resultado podría estar relacionado a la capacidad que tienen ciertas BAL
de utilizar el ácido láctico para obtener energía adicional luego del agotamiento de la
glucosa obtenida y en condiciones aeróbicas, con la producción de ácido acético y ATP
[16]–[19]. Por otra parte, en estas dos condiciones ensayadas se observó buena
formación de biomasa con producción de ácidos orgánicos, estos resultados podrían
sugerir que la bacteria podría usar otras fuentes de carbono de la matriz compleja soja
para su desarrollo. Una posibilidad es que la cepa utilice la glucosa adicional
proveniente de las IS glicosiladas, por acción de la enzima β-glucosidasa. Rodriguez de
Olmos y col. [12] mostraron incremento en esta enzima y en las IS agliconas trabajando
en condiciones similares. Otra posibilidad podría estar relacionada con el estrés
osmótico que se genera en la matriz con el mayor contenido de sacarosa presente que no
es consumida. En la PS adicionada de glucosa la cepa presentó un metabolismo
homoláctico con alta producción de ácido láctico y escasa producción de ácido acético
(Figura 2C). Un comportamiento similar se presentó cuando la PS fue adicionada con
9
fructosa (188 μmol/g), observándose el consumo total de este carbohidrato y la glucosa
presente (38,33 μmol/g) en esta matriz, al final de la fermentación. L. paracasei subsp.
paracasei CRL 207 produjo ácido láctico como principal producto de fermentación
(418 μmol/g), con una menor producción de ácido acético (32,60 μmol/g) (Figura 2 D).
En estas últimas dos condiciones, los valores obtenidos de ácido láctico fueron
próximos a los teóricos esperados, considerando que la glucosa y fructosa estarían
siendo metabolizados por medio de la vía EMB, por cada mol de azúcar utilizado se
obtienen 2 moles de ácido láctico [2], [4].
Figura 2. Comparación del desarrollo de L. paracasei en pastas de soja (PS). A: PS base sin
azúcar; B: PS adicionada con sacarosa 2%; C: PS con glucosa 2%; D: PD con fructosa 2%.
Crecimiento (log UFC/g), pH, consumo de azúcares y producción de ácidos orgánicos (μmol/g).
Los resultados presentados en este trabajo demuestran que la cepa de L.
paracasei subsp. paracasei CRL 207 utilizada cambia su perfil metabólico en la PS de
acuerdo a los azúcares presentes en la matriz, las cepas del grupo Lacticaseibacillus
poseen un metabolismo homofermentativo, pero bajo ciertas condiciones como por
ejemplo azúcar limitante, presencia de oxígeno pueden presentar una desviación de la
10
vía glicolítica normal (EMB) pudiendo generar otros productos de fermentación [3], [4],
observándose diferencias en la producción de ácidos orgánicos y, en consecuencia del
pH de la matriz. El efecto de la presencia de oxígeno se estudió en medio de cultivo
(MRS) observando un incremento en la biomasa y el pH en todas las condiciones
ensayadas, poniendo en evidencia que el oxígeno podría ser responsable en parte, del
comportamiento que la cepa presentó en las pastas de soja sin azúcar adicional.
Algunas de las enzimas presentes en esta cepa podrían estar afectadas por la
presencia de oxígeno, como la activación de la piruvato oxidasa que permite
metabolizar el piruvato a acetil-P (susceptible de fosforilación a nivel de sustrato), CO
2
y H
2
O
2
. Esta acción enzimática permite la obtención de una cantidad de energía
suplementaria (en forma de ATP) en condiciones de sustrato limitante gracias a la
producción de acetil-P para la fosforilación a nivel de sustrato por la acetato quinasa [2].
La actividad aumenta en presencia de oxígeno y se reduce en presencia de glucosa. Este
mecanismo podría ser responsable, en parte, de la energía adicional que obtiene L.
paracasei para poder desarrollar en las PS en donde no se observaron cambios
significativos en la concentración de los azúcares. Se ha demostrado en bacterias del
grupo Lacticaseibacillus, la incidencia del oxígeno sobre el aumento de la biomasa y
aumento del pH del medio por activación de la enzima piruvato oxidasa en condiciones
de baja concentración de glucosa y agitación [20], que podría ser un mecanismo
presente en la cepa bajo estudio en condiciones de sustrato limitante y presencia de
oxígeno, tanto en medio líquido como en las PS.
En los últimos años se han desarrollado trabajos donde se evaluó el efecto de la
presencia de oxígeno en condiciones de respiración, donde el suplemento de hemina y
vitamina k2 permite a las bacterias utilizar la respiración como alternativa para la
obtención de energía en condiciones de sustrato limitante y presencia de oxígeno en
distintos géneros de BAL [20]–[24]. Sería interesante evaluar en L. paracasei subsp.
paracasei CRL 207 la posibilidad de respirar bajo las condiciones estudiadas y utilizar
la energía obtenida a partir de este mecanismo, debido a que se ha demostrado que en
condiciones de respiración, las bacterias lácticas presentaron mayor tolerancia a
diferentes condiciones de estrés [25], [26], resultando interesante como estrategia para
11
aumentar la viabilidad, la seguridad y las propiedades tecnológicas y funcionales de los
alimentos fermentados con BAL [26], [27].
CONCLUSIONES
Lacticaseibacillus paracasei susbp. paracasei CRL 207 no fue capaz de
utilizar sacarosa (azúcar principal de la soja) como fuente de carbono fermentativo en la
PS ni en el caldo MRS. A diferencia de MRS, en la PS base y las adicionadas de
diferentes azúcares (sacarosa, glucosa, fructosa) la cepa alcanzó un alto crecimiento,
alcanzando diferentes pH finales y producción de ácidos orgánicos desviando el
metabolismo homofermentativo. Este comportamiento podría estar relacionado con la
presencia de oxígeno en la matriz de soja tal como se evidenció en el caldo MRS. Sin
embargo, la PS es un sustrato complejo que puede tener otras fuentes de carbono que
podrían ser utilizadas por este microorganismo para lograr una alta biomasa en las PS
fermentadas. Además, el hecho de que la cepa no sea capaz de utilizar la sacarosa
produciría una condición de sustrato limitante, junto con la presencia de oxígeno,
redirigiendo los futuros de piruvato a la obtención de otros productos finales.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo financiero a ANPCyT-FONCYT (PICT 2014 Nº
1949; PICT2019 Nº 3316) y CONICET (PIP2020 Nº 062; PUE2017-0035).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] T. Aleksandrzak-Piekarczyk, in Lactic Acid Bacteria - R & D for Food,
Health and Livestock Purposes, 2013.
[2] L. Axelsson, in Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional
Aspects, Third Edition: Revised and Expanded, 2004.
[3] J. Zheng et al, Int J Syst Evol Microbiol, 70, 4, 2020.
12
[4] M. G. Gänzle, Current Opinion in Food Science, 2. 2015.
[5] T. Zaunmüller, M. Eichert, H. Richter, and G. Unden, Applied
Microbiology and Biotechnology, 72, 3. 2006.
[6] E. Årsköld, E. Lohmeier-Vogel, R. Cao, S. Roos, P. Rådström, and E. W.
J. Van Niel, J Bacteriol, 190, 1, 2008.
[7] M. G. Gänzle, N. Vermeulen, and R. F. Vogel, Food Microbiol, 24, 2,
2007.
[8] E. Pessione, Frontiers in cellular and infection microbiology, 2. 2012.
[9] U. Hölker and J. Lenz, Current Opinion in Microbiology, 8, 3. pp. 301–
306, Jun. 2005.
[10] S. R. Couto and M. Á. Sanromán, J Food Eng, 76, 3, pp. 291–302, Oct.
2006.
[11] A. Rodríguez de Olmos, O. A. Garro, and M. S. Garro, LWT, 157, 2022.
[12] A. R. de Olmos, E. Bru, and M. S. Garro, Int J Food Microbiol, 196, pp.
16–23, 2015.
[13] J. A. Marazza, M. S. Garro, and G. Savoy de Giori, Food Microbiol, 26,
3, 2009.
[14] K. S. M. S. Raghavarao, T. V. Ranganathan, and N. G. Karanth, Biochem
Eng J, 13, 2–3, pp. 127–135, Mar. 2003.
13
[15] L. Aguirre, E. M. Hebert, M. S. Garro, and G. Savoy de Giori, LWT, 59,
2P1, 2014.
[16] M. V. Da Cunha and M. A. Foster, J Bacteriol, 174, 3, 1992.
[17] S. J. W. H. Oude Elferink, E. J. Krooneman, J. C. Gottschal, S. F.
Spoelstra, F. Faber, and F. Driehuis, Appl Environ Microbiol, 67, 1,
2001.
[18] F. Lorquet et al., J Bacteriol, 186, 12, 2004
[19] S. D. Johanningsmeier and R. F. McFeeters, Food Microbiol, 35, 2,
2013.
[20] T. Zotta et al., PLoS One, 9, 6, 2014,
[21] R. Brooijmans, B. Smit, F. Santos, J. van Riel, W. M. de Vos, and J.
Hugenholtz, Microb Cell Fact, 8, 2009.
[22] D. Lechardeur et al., Current Opinion in Biotechnology, 22, 2. 2011.
[23] M. B. Pedersen, P. Gaudu, D. Lechardeur, M. A. Petit, and A. Gruss,
Annu Rev Food Sci Technol, 3, 1, 2012.
[24] T. Zotta, A. Ricciardi, R. G. Ianniello, L. V. Storti, N. A. Glibota, and E.
Parente, Food Microbiol, 76, 2018.
[25] A. Ricciardi, M. A. Castiglione Morelli, R. G. Ianniello, E. Parente, and
T. Zotta, Ann Microbiol, 65, 3, 2015.
[26] A. Reale et al., LWT, 60, 2, 2015.
14
[27] B. Lee, S. Tachon, R. A. Eigenheer, B. S. Phinney, and M. L. Marco, J
Proteome Res, 14, 8, pp. 3136–3147, Aug. 2015.
