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Artículo recibido 15 de febrero de 2024.
Artículo aceptado 15 de julio de 2024.
Artículo publicado 31 de octubre de 2024.
Estudios de liberación en formulaciones farmacéuticas: perspectivas
actuales y desafíos
Pérez Zamora, Cristina M.1, Chiappetta, Diego A. 3,4, Nuñez, María B.1,2
1Instituto de Investigaciones en Procesos Tecnológicos Avanzados (CONICET-UNCAUS),
Comandante Fernández 755, Presidencia Roque Sáenz Peña, Chaco 3700, Argentina
2Departamento de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Nacional del Chaco Austral,
Comandante Fernández 755, Presidencia Roque Sáenz Peña, Chaco 3700, Argentina
cristinaperez@uncaus.edu.ar mbnunez@uncaus.edu.ar
3Universidad de Buenos Aires, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Cátedra de Tecnología
Farmacéutica I, Buenos Aires, Argentina.
4Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Godoy Cruz 2290,
Buenos Aires C1425FQB, Argentina dchiappetta@ffyb.uba.ar COLOCARLE SUBÍNDICE
SIN PUNTO
ORCID Cristina M. Pérez Zamora 0000-0002-5913-8130
ORCID Diego Chiappetta 0000-0001-6700-9331
ORCID María Beatriz Nuñez 0000-0001-9099-9724
Resumen
Los ensayos de liberación de fármacos son fundamentales en el desarrollo y control de
calidad de las formulaciones farmacéuticas. Estos estudios buscan entender cómo los
principios activos se liberan de sus formulaciones para poder estar disponibles y ser
absorbidos en el organismo. Para las formas farmacéuticas convencionales las
condiciones del estudio se encuentran estandarizadas en diversas farmacopeas, mientras
que para las formas farmacéuticas más novedosas, no sucede lo mismo y los
investigadores adaptan las condiciones de ensayo de acuerdo al producto a evaluar y las
condiciones del área de aplicación de la formulación. Por eso, en este artículo se realiza
una descripción de los métodos experimentales de liberación más empleados para
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evaluar las formulaciones más novedosas y los aspectos fundamentales a tener en cuenta
al momento de diseñar los ensayos de liberación. Además, se hace una breve revisión
sobre estudios de liberación en formulaciones con extractos vegetales, debido a que
estos representan un desafío por su compleja composición química.
Palabras claves: muestreo y separación, método de diálisis, formulaciones no
convencionales, protocolos estandarizados
Abtract
Release studies in pharmaceutical formulations: current perspectives and challenges
Drug release tests are essential in developing and quality control of pharmaceutical
formulations. These studies seek to understand how active ingredients are released from
their formulations to be available for absorption in the body. For conventional
pharmaceutical forms, the study conditions are standardized in various Pharmacopoeias;
while for newer pharmaceutical forms, the same does not happen. For this reason,
researchers adapt the test conditions according to the product to be evaluated and the
conditions of the application area of the formulation. Therefore, in this article, a
description of the experimental release methods most used to evaluate the most
innovative formulations is made. In addition, the fundamental aspects are reviewed, so
the reader can consider it when designing release test. Moreover, a brief review is made
of release studies in formulations with herbal extracts, because these represent a
challenge due to their complex chemical composition.
Keywords: sampling and separation, dialysis method, unconventional formulations,
standardized protocols
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INTRODUCCIÓN
Los ensayos de liberación de fármacos son estudios realizados para evaluar y
caracterizar la forma en que los principios activos o fármacos se liberan de sus
formulaciones farmacéuticas. Es un proceso por el cual un fármaco (por ejemplo:
paracetamol), incorporado en un vehículo farmacéutico (por ejemplo: comprimido de
paracetamol), pasa a la condición de fármaco libre, imprescindible para su absorción
(Telavi y Bellera, 2016). Cuando un medicamento se administra, el principio activo
debe liberarse del vehículo para que pueda ser absorbido y distribuido en el organismo,
donde ejerce su efecto terapéutico. Este proceso se tiene que dar en todas las formas
farmacéuticas, excepto en aquellas donde el fármaco ya se encuentra disuelto. Debido a
la importancia de este paso, se da especial atención a los estudios de liberación que se
emplean en formas farmacéuticas sólidas de liberación modificada.
Estos estudios se diseñan para determinar, mediante técnicas in vitro, la
cantidad de fármaco que se disuelve en función del tiempo, y evaluar de esta manera su
velocidad de liberación, y poder predecir su comportamiento una vez administrado en el
organismo. Estos ensayos permiten también sostener declaraciones de etiquetas y
realizar correlaciones in vitro/in vivo para estimar cómo se producirá la liberación en el
cuerpo (D´Souza, 2019). Además, estos estudios son críticos para el desarrollo y la
formulación de nuevos medicamentos porque permiten evaluar diferentes factores
relacionados a la formulación y a los métodos de fabricación sobre el producto
farmacéutico final. Por último, y no menos importante, son realizados constantemente
como una evaluación rutinaria de control de calidad (Amatya et al. 2013; D´Souza,
2014).
Las primeras regulaciones para ensayos de liberación aparecen en la década del
´70 en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP, por sus siglas en inglés: United
States Pharmacopeia) y Formulario Nacional (NF, por sus siglas en inglés: National
Formulary), para luego ser incorporadas en otras farmacopeas. Los estudios de
liberación son de tal importancia que permanentemente llevan a constantes revisiones y
actualizaciones del tema (D´Souza, 2019; Amatya et al., 2013; D´Souza, 2014;
Natarajan et al. 2014; Bernkop-Schnurch y Jalil, 2018; Gray et al. 2018; Fotak y Klein,
2019; Shah et al., 2022; Bayer, 2021; Chakraborty y Banzala, 2022; Abbasnezhad et al.
2022).
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En la actualidad, un gran número de publicaciones informan sobre resultados
de estudios de liberación de diferentes principios activos desde formas farmacéuticas no
convencionales. Cada uno establece condiciones de ensayo que considera apropiadas
para el tipo de formulación estudiada considerando las características de la vía de
administración. En este artículo, nos propusimos como objetivo describir los métodos
experimentales de liberación más empleados y los aspectos fundamentales a tener en
cuenta al momento de diseñar este tipo de ensayos para evitar o minimizar errores al
evaluar la formulación. No se exponen aquí aspectos relacionados al modelado
matemático de los datos obtenidos.
MÉTODOS EXPERIMENTALES USADOS EN ESTUDIOS DE LIBERACIÓN
DE FÁRMACOS
Según la forma farmacéutica (FF) a evaluar, el ensayo de liberación puede
tener diferentes condiciones de realización. Para productos farmacéuticos sólidos de
liberación inmediata administrados por vía oral, este ensayo se conoce como prueba de
disolución porque el medicamento es destinado a disolverse rápidamente en el medio de
prueba y se considera que si está disuelto, se encuentra disponible para ser absorbido
por el organismo. Para formas de dosificación no orales, como administración tópica y
transdérmica, supositorios y otros, la prueba se denomina preferiblemente como ensayo
de liberación in vitro (D´Souza, 2019) debido a que las formulaciones no se disolverán
en el sitio de absorción, pero el fármaco que contienen debe ser liberado para su
absorción.
La USP indica el uso de aparatos de disolución: Aparato I (cestas) y II (paletas)
(Figura 1) para evaluar fármacos de uso oral (comprimidos y cápsulas, de liberación
inmediata, extendida, retardada o controlada). Estos equipos son mencionados tanto en
la Farmacopea Argentina (FA VIII) como Brasilera (ANVISA, 2010). Además, el
Aparato II puede usarse en la evaluación de suspensiones orales (Fotak y Klein, 2019).
Los Aparatos III (cilindro alternativo) y IV (celda de flujo continuo) (Figura 2) se
diseñaron para formas de dosificación oral de liberación prolongada, y son mencionados
en la Farmacopea Europea (2013), pero no en las Farmacopeas Argentina y Brasilera. El
Aparato IV de celdas de flujo es recomendado para evaluar la liberación desde
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implantes subcutáneos o intramusculares, debido a que el flujo del medio en cierto
modo imita al flujo de la sangre (Gray et al., 2018; Abbasnezhad et al. 2022). Los
Aparatos V (paletas sobre disco), VI (cilindro giratorio) y VII (soporte alternativo) se
usan para las formas de administración vía transdérmica como parches, y no están
mencionados en las Farmacopeas Argentina, Brasilera y Europea, pero en la USP
(2018).
Figura 1. Esquema representativo del
Aparato I (con accesorio canasto) y Aparato
II (con accesorio paleta).
Figura 2. Esquema del sistema empleado con
el Aparato IV, de celdas de flujo.
Para formas farmacéuticas novedosas como los sistemas particulados
(nano/micro), emulsiones (nano/micro), liposomas, láminas e hidrogeles, inyectables e
implantes de liberación controlada, no hay condiciones estandarizadas acerca de cómo
realizar los ensayos de liberación (D´Souza, 2019; Gray et al., 2018; Fotak y Klein,
2019; Shah et al., 2022). Advirtiendo esta situación, a partir del 2017, la USP y la FDA
(Food and Drug Administration) dan una serie de sugerencias para estudios de
liberación de este tipo de formulaciones, donde involucran el uso del Aparato II, IV y el
VII (Gray et al., 2018; FDA, 2022). Debido a esta ausencia de estándares, los
investigadores adaptan el ensayo considerando las condiciones más apropiadas para el
producto en estudio. Los métodos más empleados, se pueden clasificar en 2 grandes
grupos: i) método de muestra y separación, y ii) método de difusión por membrana.
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Método de muestra y separación
Con este método, la formulación se introduce directamente en el medio de
liberación, el cual se mantiene a temperatura constante y con agitación durante todo el
ensayo. Luego se extraen muestras del medio de liberación a intervalos de tiempos
predeterminados, para cuantificar la concentración de fármaco liberado. Por lo general,
la muestra extraída se filtra, en algunos casos se centrifuga, luego se filtra y recién
entonces se analiza el sobrenadante. Si quedan partículas del estudio, tal como se
muestra en el esquema de la Figura 3, pueden reponerse al medio de liberación, previa
reconstitución con un volumen determinado de medio de liberación equivalente al
volumen extraído.
Figura 3. Esquema de las etapas del método de muestreo y separación en el cual se pueden
apreciar micropartículas (verdes), cargadas con fármaco (rojo), que se liberan al medio acuoso.
Este método proporciona un enfoque simple y directo, siendo satisfactorio si la
formulación dispersa y el medio de liberación pueden separarse fácilmente, resultando
útil para la evaluación de formulaciones como micropartículas y diferentes formas de
apósitos laminares, entre otros (Yousefi et al., 2019, 2020; Keskir et al., 2019;
Ramalingam et al., 2019; Shokrollahi et al., 2020; Ahmadi et al., 2021; Almasian et al.
2020; Pérez Zamora et al., 2022). Existe una variedad de adaptaciones de este método
que incluyen el Aparato I (Gupta et al., 2021), el Aparato II (Edikresnha et al., 2019), el
uso de vasos de precipitados o frascos viales (Yousefi et al., 2019, 2020; Keskir et al.,
2019; Ramalingam et al., 2019; Shokrollahi et al., 2020; Ahmadi et al., 2021; Almasian
et al. 2020; Pérez Zamora et al., 2022; Flamminii et al. 2020). La cuantificación del
principio activo se realiza generalmente por cromatografía líquida de alta performance
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(HPLC) o espectrofotometría UV-visible. Este método no es adecuado para sistemas
como emulsiones, liposomas, geles o nanopartículas.
Método de difusión por membrana o método de diálisis
Este método es muy versátil, siendo uno de los más empleados para
formulaciones nanométricas y también para estudiar la liberación desde depósitos a base
de aceites, liposomas, partículas poco solubles en agua o sistemas autoemulsionados
(Amatya et al., 2013; Bernkop-Schnurch y Jalil, 2018; Kim et al., 2021; Marques et al.,
2011; Baran et al., 2018).
En este método, la formulación a evaluar se separa del medio de liberación
mediante una membrana semipermeable de tamaño de poro conocido. Esta membrana
dejará pasar sólo al fármaco disuelto al medio de liberación, para luego ser cuantificado.
Existen varias adaptaciones de este método (Amatya et al., 2013; D´Souza, 2014; Kim
et al., 2021), pero el más empleado es el uso de bolsas de diálisis elaboradas con
polímeros no hidrosolubles. En esta técnica, la formulación a evaluar se coloca dentro
de la bolsa junto a una pequeña cantidad de medio de liberación (por ejemplo, entre 1 y
10 ml). Los extremos de la bolsa deben estar bien sellados. Luego se la sumerge en un
volumen mayor de medio, entre 50 y 500 ml, o más (Figura 4). Se produce una
agitación continua en el medio de liberación, la cual dependerá del recipiente que se
emplee, si se usan vasos de precipitados, se emplean pequeños volúmenes (50-100 ml) y
agitación magnética. Otros estudios se realizan con el Aparato II (accesorio paletas)
sumergiendo la bolsa de diálisis en el fondo del vaso, empleando un volumen de 500
ml. En este método, las condiciones de agitación, la relación entre el volumen de celda
donante y el del receptor, y el peso molecular de la membrana, pueden afectar el
proceso de liberación. Se recomienda que la membrana sea de 100 veces el tamaño
molecular del fármaco (Gupta et al., 2021) para que deje pasar sólo a la molécula del
fármaco, pero no a los otros excipientes de la formulación, y que si estos permean, no
representen una interferencia para la cuantificación. Es importante que los extremos de
la bolsa se encuentren bien sellados, de lo contrario puede haber pérdidas y se pueden
producir alteraciones si no se cumplen las condiciones de sumidero (“sink”). Además,
hay que considerar que algunos fármacos pueden unirse a la membrana y esto afecta a la
cantidad cuantificada de fármaco.
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Una variante del método es la diálisis inversa, donde el medicamento se coloca
fuera de la membrana y el muestreo se realiza dentro de la membrana. La ventaja es que
la agitación previene la agregación de partículas (Amatya et al., 2013). Existen otras
configuraciones como, por ejemplo, el uso del Aparato I con una cesta de vidrio y una
membrana de diálisis en la parte inferior (D´Souza, 2014), o el uso del Aparato II con
una bolsa de diálisis en el fondo (Bao et al., 2022).
Figura 4. Representación esquemática
del uso de membranas de diálisis para
evaluar la liberación de un fármaco
(puntos rojos) desde partículas (esferas
verdes), empleando un vaso de
precipitado con medio acuoso y agitación
magnética.
Liberación con celdas de Franz
Este método es menos popular, pero lo desarrollamos aquí porque es de gran
utilidad para evaluar formulaciones semisólidas de uso tópico como emulsiones, geles o
ungüentos. Tal como se representa en la Figura 5, la celda de Franz cuenta con un
compartimento dador donde se carga la muestra, y un compartimento receptor, donde se
encuentra el medio de liberación. Ambos son separados por una membrana, la cual
puede ser una membrana de diálisis o una membrana sintética inerte que sólo actúa de
sostén para la formulación pero que no interfiere en la difusión. La cantidad de muestra
cargada debe representar una dosis típica. El medio de liberación se mantiene a
temperatura constante mediante un sistema de camisa de agua, y en constante agitación
magnética. Las formulaciones tópicas generalmente se evalúan a 32 °C. Se puede
realizar el ensayo a 37 °C cuando el producto está destinado a una aplicación tópica
como puede ser la mucosa vaginal (por ejemplo, cremas vaginales).
Las formulaciones semisólidas no presentan condiciones de liberación
estandarizadas en las farmacopeas, pero la FDA presenta recomendaciones al respecto
en las guías para la industria SUPAC-SS (1997) donde indica el uso de celdas de
difusión vertical (celdas de Franz) y las condiciones del ensayo.
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Figura 5. Ilustración de una celda de Franz cargada con una formulación en gel (verde) que
contiene un principio activo (puntos rojos) que es liberado, y tiene la capacidad de solubilizarse
y pasar a través de una membrana hacia el medio acuoso en el compartimento receptor.
FACTORES CLAVES PARA EL DISEÑO DE UN ESTUDIO DE LIBERACIÓN
Los factores claves que influyen en el proceso de liberación, y por lo tanto
condicionan el diseño del estudio, son: el recipiente, la velocidad de agitación, la
composición del medio de liberación (pH, presión osmótica, tensión superficial), la
cantidad de muestra y la estabilidad del principio activo (Chakraborty y Banzala, 2022;
Kim et al., 2021). El recipiente define el volumen de medio a utilizar y el modo de
agitación (D´Souza, 2019). Es importante que la agitación se pueda realizar de forma
controlada y reproducible, independientemente del mecanismo de agitación.
Respecto a los medios de liberación, se eligen considerando la solubilidad y
estabilidad del principio activo (Fotak y Klein, 2019). Se prefieren medios de disolución
simples como soluciones tampón acuoso debido a su costo, facilidad de preparación y
reproducibilidad; aunque en situaciones particulares puede requerirse condiciones
diferentes, que se evaluarán y justificarán debidamente (Marques et al., 2011). Es
importante garantizar que el medio de disolución no se sature durante el ensayo, por lo
tanto también es clave la relación entre cantidad de medio y cantidad de formulación.
Como regla general, se recomienda que la concentración del fármaco en el medio de
disolución/liberación se mantenga por debajo del 10% (D´Souza, 2019). Esto garantiza
una condición sink o de sumidero durante el estudio, es decir, que el medio tenga una
concentración baja constantemente, de manera tal que se favorezca el proceso de
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difusión del principio activo desde la formulación hacia la disolución y no se alcance el
equilibro en el proceso, ya que si esto sucede, la liberación se detendrá. Si el fármaco es
poco soluble en agua, está permitido agregar solventes no acuosos o agentes
solubilizantes. Es fundamental estudiar la tasa de liberación en función de la
concentración de solubilizante para garantizar que éste no influirá en la liberación del
fármaco. Hay que tener en cuenta que si el disolvente penetra en la matriz, es probable
que influya en la velocidad de liberación.
El volumen de muestra que se extrae está definido por la sensibilidad de la
técnica de cuantificación (D´Souza, 2019; Fotak y Klein, 2019), y se recomienda
reponer el volumen extraído para garantizar la condición de sumidero.
Respecto de la temperatura del ensayo, como se mencionó previamente, los
ensayos se pueden realizar en algunos casos a 32 °C o a 37 °C, según la vía de
administración. En algunas condiciones se plantean ensayos a mayor temperatura para
acelerar la liberación de formulaciones que lo hacen en tiempos muy prolongados
(Chakraborty y Banzala, 2022; Kim et al., 2021). Lo importante es garantizar que la
temperatura se mantenga constante a lo largo de toda la duración del ensayo, que puede
ser desde minutos, horas y hasta meses (D´Souza, 2019; Fotak y Klein, 2019). Para
períodos largos de estudio, es importante considerar la evaporación del medio y tratar de
evitarla (Gray et al., 2019).
ESTUDIOS DE LIBERACIÓN EN FORMULACIONES CON EXTRACTOS
VEGETALES O PRODUCTOS NATURALES
Los extractos vegetales son de interés para una gran variedad de actividades
biológicas. Una formulación farmacéutica que contenga como principio activo un
extracto vegetal, al momento del diseño y caracterización, presenta los mismos desafíos
que las formulaciones elaboradas con principios activos de síntesis. El ensayo de
liberación es uno de los ensayos de caracterización más importante del producto. En
este punto, se presenta una dificultad adicional para evaluar la liberación del
componente activo del extracto, dado que presenta una composición compleja debido a
la variedad de metabolitos vegetales que contiene. Muchas veces, la actividad biológica
es dada por una interacción sinérgica entre esos metabolitos y no por la presencia de
uno solo, por lo que se dificulta identificar y cuantificar a la molécula responsable de la
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actividad biológica de interés. Por lo tanto, ¿cómo se puede garantizar que se libera el
componente bioactivo de la formulación, y que la formulación mantiene la actividad
biológica del extracto?
Gran cantidad de artículos científicos analizan el desarrollo de formulaciones
farmacéuticas incorporando extractos vegetales, y en su caracterización plantean su
propio diseño para el estudio de liberación. Para micropartículas con extractos se
informó el uso del método por muestra y separación. Por ejemplo, al estudiar la
liberación de un extracto mixto de Foeniculum vulgare, Cuminum cyminum, Trigonella
foenum y Anethum graveolens, vehiculizado en micropartículas de quitosano (Yousefi et
al., 2019), se dispersaron 300 mg en 100 ml de dos medios acuosos diferentes (pH 1,5 y
7,0), a 37 °C, durante 24 h, con agitación a 100 rpm. Se extrajeron muestras de 5 ml con
reposición del medio. Las muestras se analizaron para cuantificar flavonoides mediante
una técnica espectrofotométrica que implica una reacción previa con cloruro de
aluminio. Se observó que a pH 1,5 se produjo una liberación inicial rápida (32,9%)
durante las primeras 6 h, seguida de una liberación lenta y continua (55,19%). En medio
neutro, se observan ambas fases de liberación, rápida y lenta, en período similares, pero
alcanza un mayor porcentaje de liberación al final (85%). Aplicando la misma
metodología, cuando se evaluaron micropartículas de alginato recubiertas con quitosano
(Yousefi et al., 2020), a pH 1,5 se produjo una liberación inicial rápida (22,11%) en los
primeros 40 min, seguida de una liberación sostenida hasta las 2 h (43,21%). Sin
embargo, a pH 7 se alcanzó una liberación de 95,39 % a las 2 h. En otro estudio, se
evaluó la liberación del extracto de propóleo desde microcápsulas de alginato de calcio
durante 2 h a 37 °C (Keskir et al., 2019). Para ello dispersaron 0,15 g en 30 ml de tres
soluciones diferentes (pH 1,5; 6,8 y 7,4), añadiendo Tween® 80 al 1% para aumentar la
solubilidad del extracto en el medio de liberación. Se cuantificaron los polifenoles
totales liberados mediante la técnica espectrofotométrica que emplea el reactivo de
Folin-Ciocalteau. Se observaron diferencias en la liberación a diferentes pH, con mayor
liberación (~100%) a pH 7,4 y mínima liberación (<20%) a pH 1,5. Se puede apreciar
cómo el pH influye en la liberación, independientemente de la composición de la
formulación.
Algunas formulaciones diseñadas como apósitos de heridas, suelen emplear
diferentes tecnologías en su elaboración (Ramalingam et al., 2019; Shokrollahi et al.,
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2020; Ahmadi et al., 2021; Almasian et al. 2020; Pérez Zamora et al., 2022) y están en
auge en los últimos años. Para los estudios de liberación, un trozo del apósito se
suspende en el medio de liberación, que por lo general es solución tampón con pH entre
7 y 7,4, con agitación a 37 °C. Por ejemplo, para apósitos electrohilados de gelatina y
quitosano conteniendo extracto de canela (Cinnamom), una pieza de 2 x 2 cm se
sumergió en 5 ml de medio, a 37°C, durante seis días. En tiempos predefinidos, se
extrajo 1 ml de muestra (con reposición del medio) y se registró el espectro de
absorbancia (180-700 nm). De manera similar al comportamiento de micropartículas, se
observó una liberación brusca en las primeras 6 h, seguida de una liberación lenta de
orden cero; liberando el 15% del extracto en 5 días y cerca del 70% el sexto día. Los
autores estiman que la liberación podría mantenerse por 16 días más. En otros trabajos,
se emplearon otras condiciones para formulaciones similares. Por ejemplo, para láminas
electrohiladas de alcohol polivinílico y quitosano, conteniendo extracto de manzanilla
(Shokrollahi et al., 2020), piezas de 4 x 4 cm se sumergieron en 8 ml de medio. Se
extrajeron 2 ml de muestra con reposición del medio. Se cuantificó la cantidad de
extracto liberado mediante el registro de absorbancia a una longitud de onda fija,
predeterminada. Se observó una liberación brusca en las primeras 5 h, seguida de una
liberación gradual, alcanzando al final del ensayo (luego de 336 h) liberar entre 35-73%,
dependiendo de la composición de la formulación. Por otro lado, en apósitos tipo
películas laminares elaborados con extractos de Lippa alba y L. turbinata se ha
observado un perfil de liberación de polifenoles similar, con una liberación inicial
brusca y luego un período de liberación más lento, pero en menor, tiempo superando el
85% de liberación en 2 h (Pérez Zamora et al., 2022). En estos ejemplos, probablemente
tanto la composición como la técnica de preparación del producto formulado influyen
en el perfil obtenido.
Para formulaciones de tipo liposomas se emplea el método de diálisis, debido a
que estos sistemas son de escala nanométrica. En niosomas (un tipo de liposoma,
elaborados con Span® 60, Tween® 60 y colesterol) con extracto de henna (Lawsonia
inermis) la liberación se estudió cargando 1 ml de formulación dentro de bolsas de
diálisis y sumergiéndola en 50 ml de solución tampón (pH 7,4), agitado a 150 rpm, a 37
°C, durante 15 h (Baran et al. 2018). Periódicamente se extrajo 1 ml de muestra (con
reposición del volumen extraído). La cuantificación se hizo mediante el registro de la
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absorbancia a una longitud de onda fija e interpolación en la curva de calibración.
Condiciones de ensayos similares fueron empleadas para estudiar la liberación de D-
limoneno (compuesto natural bioactivo) vehiculizado en niosomas (formulados con
Span® 40, Tween® 40 y colesterol), pero además se agregó 30 % de etanol al medio de
liberación para aumentar la solubilidad del compuesto en el medio (Hajizadeh et al.,
2019). Para el extracto de henna se observó una liberación rápida dentro de las primeras
4 h y luego una liberación lenta. Sin embargo, para D-limoneno la liberación fue lenta
desde un principio y a lo largo de todo el ensayo. En ambas formulaciones, la cantidad
máxima liberada estuvo por debajo del 60 %. En estos ejemplos, los diferentes
resultados pueden deberse a la composición de la formulación, composición del medio
de liberación y las limitaciones de solubilidad del compuesto o extracto vehiculizado.
Algunos autores informaron para formulaciones autoemulsionables, el empleo
del Aparato II de disolución con bolsas de diálisis cargadas con la formulación y
sumergidas en el fondo del vaso. Por ejemplo, se utilizó esta adaptación, en la
evaluación de una formulación destinada a la absorción vía gastrointestinal (Marrero-
Morfa et al., 2023) y para una formulación semisólida de aplicación tópica (Ahmad et
al., 2018). Las condiciones del ensayo se adaptaron a la vía de administración y la
cuantificación del extracto liberado se realizó con HPLC y cromatografía en capa
delgada de alta resolución (HPTLC, high-performance thin layer chromatography).
En muchos trabajos, los estudios de liberación se complementan con pruebas in
vitro que demuestran que los metabolitos liberados mantienen la actividad biológica del
extracto.
REFLEXIONES FINALES
Actualmente en las Farmacopeas Argentina y Brasilera se indica cómo realizar el
ensayo de liberación lo para comprimidos o cápsulas (test de disolución). La
Farmacopea de los Estados Unidos y la Farmacopea Europea, especifican además cómo
hacer el ensayo de liberación para parches. Desde hace más de dos décadas, se ha
planteado la necesidad de contar con condiciones estándares unificadas para realizar
estos estudios en FF más novedosas. Sabemos que no es posible establecer un sistema
de prueba único para todas las FF, pero pensar en condiciones estandarizadas para
cada tipo de FF. En este sentido y atendiendo a esta necesidad, en los últimos años la
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USP y la FDA emitieron sugerencias y orientaciones sobre cómo realizar ensayos de
liberación para nanosuspensiones, liposomas e implantes. Sin embargo, a pesar de ello,
se pueden apreciar diferencias metodológicas en los estudios de liberación realizados
por diferentes autores para productos similares. En consecuencia, los resultados no son
comparables. En muchos casos, la metodología empleada es cuestionable. Por ejemplo,
usar el método de muestra y separación para apósitos de uso tópico, cuando tal vez
pueda ser más adecuado realizar el estudio con celdas de Franz, debido a que en el
primer método el apósito se sumerge completamente en solución produciéndose la
liberación desde todos sus lados, situación que no se daría in vivo, donde sólo una de las
caras entra en contacto con el área de aplicación, a partir de la cual se producirá la
liberación. Y aquí es importante tener en cuenta las condiciones de humedad del estudio
porque también influyen en el proceso de liberación. Algo similar se puede plantear
para formulaciones de tipo emulsiones tópicas, con liposomas o partículas. Para estas
formulaciones se suele emplear el método de difusión por membrana, y debido al uso
que tendrán, es más apropiado realizar el estudio empleando un sistema tipo celda de
Franz.
Los ensayos de liberación con las muestras sumergidas en la solución, a través
del modelado matemático de los resultados del estudio, permiten conocer el mecanismo
físico por el cual se produce la liberación del principio activo desde el vehículo
farmacéutico, pero no pueden representar el comportamiento real del producto aplicado
en la piel. Además, las membranas de diálisis pueden adsorber rmacos, especialmente
si se trata de pequeñas cantidades de fármacos tensioactivos o hidrofóbicos.
En artículos científicos se puede apreciar que al no haber condiciones
estandarizadas para los ensayos de liberación de muchas FF novedosas, los científicos
adaptan las condiciones para realizarlos. Es necesario seguir trabajando para finalmente
unificar criterios y establecer, a través de organismos oficiales y sus instrumentos,
condiciones estandarizadas de estudios de liberación para cada tipo de FF.
En cuanto al estudio de formulaciones con extractos vegetales, los métodos de
cuantificación propuestos por varios autores resultan interesantes por su practicidad, y
sencillez. Demuestran la liberación de flavonoides y polifenoles, que se asocian con
diferentes actividades biológicas, proporcionando estrategias viables. Para
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complementar los estudios en estos productos, será necesario establecer pruebas que
garanticen que las sustancias liberadas mantienen la actividad biológica de interés.
REFERENCIAS BIBIOGRÁFICAS
Abbasnezhad, N., Zirak, N., Champmartin, S., Shirinbayan, M. y Bakir, F. (2022). An
overview of in vitro drug release methods for drug-eluting stents. Polymers,
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