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Artículo recibido 4 de julio de 2025.
Artículo aceptado 15 de septiembre de 2025.
Artículo publicado 5 de octubre de 2025.
Estudio de bacterias lácticas nativas, evaluación de combinación de
nisina y antibióticos contra patógenos resistentes
Rivas, Franco P.
1,2
; Aguzín Ferreyra, Mauricio E.
1
; Garro, Marisa S.
3
; Garro, Oscar
A.
1,2
1
Universidad Nacional del Chaco Austral (UNCAUS). Presidencia Roque Sáenz Peña, Chaco,
Argentina
2
Instituto de Investigaciones en Procesos Tecnológicos Avanzados (INIPTA)-
CONICET/UNCAUS. Presidencia Roque Sáenz Peña, Chaco, Argentina
3
Centro de Referencia para Lactobacilos (CERELA)-CONICET-FML-FECIC. San Miguel de
Tucumán, Tucumán, Argentina.
rivas@uncaus.edu.ar; mau.aguzin@gmail.com; msgarro2002@yahoo.com.ar;
garro@uncaus.edu.ar
ORCID Franco Paolo, Rivas 0000-0003-4332-5975
ORCID Mauricio Emanuel, Aguzín Ferreyra, 0009-0009-5927-9919
ORCID Marisa Selva, Garro 0000-0003-4496-4584
ORCID Oscar Alfredo, Garro 0000-0003-4106-2315
Resumen
El aumento de la resistencia bacteriana a los antibióticos ha impulsado la urgente
necesidad de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. El objetivo del presente trabajo
fue evaluar el potencial de bacteriocinas y sus combinaciones con antibióticos para
inhibir el crecimiento de bacterias resistentes a antibióticos. Bacterias lácticas (BL)
aisladas a partir de frutos nativos de la provincia del Chaco (Argentina): Algarrobo
blanco (Neltuma alba), Chañar (Geoffroea decorticans), Tutiá (Solanum
sisymbriifolium) y Tuna (Opuntia ficus-indica (L.) Mill.), fueron ensayadas por su
producción de bacteriocinas. Ninguna BL fue productora de bacteriocina. La eficacia de
2
nisina y sus combinaciones con 4 antibióticos comerciales fue analizada frente a
patógenos clínicos resistentes aislados en nosocomios de Sáenz Peña (Chaco). Se
encontraron 3 combinaciones de nisina y oxacilina que exhibieron interacción sinérgica
contra cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina y 1 combinación que
desarrolló efecto aditivo. No se encontró interacción positiva frente a las bacterias
Gram-negativas evaluadas. Estos hallazgos sugieren que la nisina, si bien es efectiva
contra ciertos patógenos Gram-positivos, no presenta ventajas adicionales contra Gram-
negativas al combinarse con antibióticos. Resaltando la necesidad de continuar aislando
y caracterizando nuevas BL productoras de bacteriocinas efectivas contra una gama más
amplia de patógenos, especialmente Gram-negativos.
Palabras clave: bacterias resistentes, bacteriocinas, nisina
Abstract
Study of the use of bacteriocin and its combinations with commercial antibiotics against
resistant bacteria
The increase in bacterial resistance to antibiotics has driven the urgent need to develop
new therapeutic strategies. The objective of this study was to evaluate the potential of
bacteriocins and their combinations with commercial antibiotics to inhibit the growth of
antibiotic-resistant bacteria. Lactic acid bacteria (LAB) isolated from native fruits of
Chaco Province (Argentina): white carob (Neltuma alba), Chañar (Geoffroea
decorticans), Tutiá (Solanum sisymbriifolium), and prickly pear (Opuntia ficus-indica
(L.) Mill.), were tested for their bacteriocin production. No LAB produced bacteriocins.
The efficacy of nisin and its combinations with four commercial antibiotics was
analyzed against resistant clinical pathogens isolated in hospitals in Sáenz Peña
(Chaco). Three combinations of nisin and oxacillin were found to exhibit synergistic
interaction against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains, and one
combination developed an additive effect. No positive interaction was found against the
Gram-negative bacteria tested. These findings suggest that nisin, although effective
against certain Gram-positive pathogens, does not offer additional advantages against
3
Gram-negative bacteria when combined with antibiotics. This highlights the need to
continue isolating and characterizing new LAB that produce bacteriocins effective
against a wider range of pathogens, especially Gram-negative.
Keywords: resistant bacteria, bacteriocins, nisin
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias lácticas (BL) son un conjunto amplio y diverso de bacterias
pertenecientes al orden Lactobacillales. A pesar de tal diversidad, las BL poseen ciertas
características en común las cuales permiten agruparlas y diferenciarlas de otros tipos de
bacterias, como lo son el ser bacterias Gram positivas, anaerobias facultativas,
desprovistas de citocromos, catalasa negativa, oxidasa negativa, no productoras de
esporas, carentes de motilidad (salvo contadas excepciones), con forma de coco o bacilo
(Bergey´s Manual).
Las BL son microorganismos ubicuos y ampliamente distribuidos en la
naturaleza, por lo que pueden ser aisladas de alimentos o productos fermentados, como
leche, yogur, queso, chucrut o kéfir; aunque también pueden ser encontradas en el suelo,
en la superficie de vegetales no fermentados (tomate, manzana, naranja, mandarina,
ananá, entre otros) o colonizando el tracto gastrointestinal del ser humano u otros
animales, formando parte de la microbiota normal (Pereira Barbosa et al., 2022).
Algunas BL poseen la capacidad de producir compuestos de gran interés
científico e industrial denominados “bacteriocinas”. Si bien la mayoría de las
bacteriocinas presentan actividad principalmente dirigida hacia bacterias Gram
positivas, existen bacteriocinas de amplio espectro activas contra bacterias Gram
negativas, hongos patógenos, células tumorales e incluso virus (Orrego Andrade &
Lobos Gilabert, 2020).
De acuerdo a Ruiz et al. (2023), actualmente, las únicas bacteriocinas
aprobadas por la FDA para su uso en alimentos son la nisina y la pediocina, pero sólo la
nisina cuenta con la aprobación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la
European Food Safety Authority. En el contexto de la República Argentina, la nisina es
la única bacteriocina aprobada para su uso en alimentos como conservante
(Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, 2023). La
4
nisina es un lantibiótico, nombre que se deriva de la presencia del aminoácido
lantionina, por lo que su mecanismo de acción consiste principalmente en la formación
de poros en la membrana plasmática bacteriana. Desde el punto de vista de la industria
farmacéutica y de la salud humana, las bacteriocinas representan una herramienta
alternativa y prometedora en la lucha contra microorganismos multirresistentes.
La OMS (2016), considera que la resistencia a los antibióticos es un evento que
ocurre cuando los microorganismos (bacterias, hongos, virus y parásitos) se adaptan y
se vuelven capaces de crecer en presencia de antibióticos ante los cuales antes eran
sensibles, volviéndolos ineficaces para su tratamiento. Las bacterias multirresistentes
son una preocupación creciente en la salud pública debido a que son microorganismos
difíciles de tratar y pueden provocar infecciones graves y potencialmente mortales,
además de que impiden garantizar procedimientos complejos (cirugías, quimioterapias,
etc.) con bajos riesgos (Shin et al.,2015; Serra-Burriel et al., 2020).
Es debido a esto que el estudio de nuevas alternativas que permitan mitigar
estos problemas es tan necesario como urgente. Tal es el caso de la investigación del
poder antimicrobiano de las bacteriocinas, las cuales ya han reportado tener capacidad
tanto bacteriostática como bactericida al ser evaluadas contra patógenos
multirresistentes (Shin et al., 2015; Delpech et al., 2017). En este contexto, las
bacteriocinas cuentan con las ventajas de ser compuesto de tamaño muy pequeño, que
actúan de forma rápida y ante los cuales los microorganismos desarrollan resistencia de
manera mucho más lenta en comparación con los antibióticos comunes (Aguirre &
Litterio, 2017; Jensen et al, 2020).
Otra estrategia posible es la de la administración simultánea de antibióticos y
bacteriocinas que exhiban un comportamiento antibacteriano sinérgico. Esto, además,
permitiría disminuir la concentración de antibiótico necesaria para inhibir de manera
efectiva el crecimiento de tales bacterias durante el tratamiento, disminuyendo la
presión selectiva sobre la bacteria y minimizando la probabilidad de ocurrencia de
toxicidad medicamentosa debida a las altas dosis de antibióticos necesarias (Tong et al.,
2014)
Desde el descubrimiento de la primera bacteriocina en el año 1925 por el
bacteriólogo británico Frederick W. Twort (Rios et al., 2016), muchos otros compuestos
pertenecientes a esta categoría han sido y continúan siendo descubiertos a medida que
5
se intensifica el estudio de nuevos nichos en los que se desarrollan bacterias capaces de
producirlos como, por ejemplo, las BL. Es en consecuencia a todo lo anteriormente
citado, y con motivo de revalorizar la región del Noreste Argentino (NEA) en términos
de biodiversidad, es que se enmarca la importancia de la investigación de las BL
productoras de bacteriocinas aisladas a partir de vegetales autóctonos del Chaco. Así,
determinar el uso potencial de estas nuevas bacteriocinas y de nisina (bacteriocina de
uso comercial) frente a bacterias resistentes a antibióticos, y la combinación de las
mismas con antibióticos comerciales, como posible medida para uso terapéutico.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Selección y recolección del material vegetal
Se utilizaron los frutos de las siguientes plantas autóctonas de la región NEA,
que fueron recolectados en su lugar de origen durante el año 2024: algarrobo blanco
(Neltuma alba), recolectado en zona rural (26° 28’ 08,787” S, 60° 14’ 59,1122” W);
chañar (Geoffroea decorticans (Gill. Ex Hook. Et Arn.) Burk.), recolectado en zona
rural (26° 28’ 08,787” S, 60° 14’ 59,1122” W); tuna (Opuntia ficus-indica (L.) Mill.),
recolectada en zona urbana periférica de Presidencia Roque Sáenz Peña, Chaco (26° 48’
28” S, 60° 27’ 00” W); tutiá (Solanum sisymbriifolium Lam.), recolectado en zona rural
(26° 28’ 08,787” S, 60° 14’ 59,1122” W).
Una vez recolectados, los frutos fueron transportados al laboratorio en
condiciones de refrigeración y se analizaron en un plazo no mayor a 48 horas.
2.2. Aislamiento y selección de bacterias ácido lácticas
El material vegetal fue lavado con agua destilada, luego procesado por
disgregación mecánica con agua de peptona estéril para realizar diluciones seriadas,
sembradas en MRS-Agar (1,2%) suplementado con sorbato de potasio al 0,02% (para
evitar el crecimiento de mohos y levaduras), incubadas a 30ºC por 48-72 horas bajo
condiciones anaeróbicas. A partir de estas placas, se seleccionaron aleatoriamente entre
5 y 10 colonias, las cuales fueron purificadas sobre el mismo medio.
Los cultivos seleccionados fueron caracterizados preliminarmente usando
tinción de Gram, morfología celular y reacción de catalasa (Bergey´s Manual). Los
6
aislamientos Gram positivos y catalasa negativos fueron almacenados a -80ºC en caldo
MRS + 20% (v/v) de glicerol.
2.3. Actividad antimicrobiana (producción de sustancias del tipo bacteriocina)
2.3.1. Screening para actividad antimicrobiana
Dicho ensayo fue realizado siguiendo la metodología descripta en Rivas et al.,
2025. Brevemente, placas de Petri se cubrieron con 15 ml de agar BHI fundido (agar al
1%), se inocularon con 30 μl de un cultivo activo del microorganismo indicador (MI),
en el que se formaron pocillos de 5 mm con un sacabocado estéril. Luego, se colocaron
30 μl de un cultivo activo del aislamiento de BL en cada pocillo. Las placas se
incubaron durante 24 h a la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo
indicador. La aparición de zonas transparentes de 6 mm o más grandes alrededor del
pocillo, se calificaron como inhibición positiva. A tal efecto, se emplearon los
siguientes MI; bacterias Gram positivas: Listeria (L.) innocua ATCC 33090, L. innocua
7, Staphylococcus (S.) aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. epidermis
ATCC 12228, Brochothrix thermosphacta 405 y Enterococcus faecalis; bacterias Gram
negativas: Escherichia (E.) coli ATCC 35218 y E. coli FBUNT (Facultad de
Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Argentina).
2.3.2. Caracterización de los compuestos antibacterianos
Para esta determinación, por cada cepa de BL que presentó actividad
antimicrobiana en el ensayo anterior (2.3.1.) se utilizó una placa de Petri sembrada con
cada MI frente al cual había exhibido actividad, aplicando metodología descrita en
Rivas et al., 2025. Brevemente, estos aislados se cultivaron durante 12 h a 30 °C en caldo
MRS. Luego, el cultivo bacteriano se centrifugó (4000 g, 10 min a temperatura ambiente) y
filtró (membrana de acetato de celulosa de 0,22 μm de tamaño de poro) para obtener un
sobrenadante libre de células (SLC). La inhibición ácida se descartó mediante el ajuste de pH de
las muestras a pH 6,5 (con NaOH 1 N). La actividad inhibitoria del peróxido de hidrógeno se
descartó mediante la adición de catalasa (300 UI/ml). La naturaleza proteínica de los
compuestos antimicrobianos se determinó mediante la adición de enzimas proteolíticas: tripsina,
papaína y proteinasa K (concentración final de 1 mg/ml). Las muestras se incubaron durante 24
h a 30 °C.
7
2.4. Determinación del perfil antibacteriano frente a patógenos clínicos
Se realizó la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de
nisina y de los antibióticos: gentamicina, norfloxacina y ampicilina para E. coli y
oxacilina y gentamicina para Staphylococcus, mediante el método de microdilución en
caldo (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006). Las dosis de nisina empleadas
fueron: 1000 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL y 62,5 µg/mL. Se usaron
concentraciones de antibióticos diferentes de acuerdo al perfil de resistencia aportado
por las instituciones que aislaron cada bacteria resistente. En esta etapa se emplearon
ocho bacterias patógenas resistentes de origen clínico provistas por los laboratorios de
análisis clínico del Hospital 4 de Junio y de la Unidad Médica Educativa (UME-
UNCAUS), ambos de la ciudad de Presidencia Roque Sáenz Peña (Tablas 1 y 2). Cinco
cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (SARM): UME1, S. aureus
(Sa)5307, Sa5357, Sa5646 y Sa5627; y tres E. coli resistentes a ampicilina: Ec4905,
Ec1785 y Ec1763; cuyos perfiles de resistencia antimicrobiana, fueron aportados por los
centros de salud que realizaron los aislamientos. Además, se estudiaron cepas derivadas
de la colección de cultivos ATCC: S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S.
epidermidis ATCC 12228 y E. coli ATCC 35218.
Tabla 1: Perfil de resistencia antimicrobiana de los aislamientos clínicos de Staphylococcus
aureus.
Sa5627
Sa5646
UME1
Sa5307
Sa5357
Eritromicina
S
R
S
S
S
Clindamicina
S
R
S
S
S
Trimetoprima-
sulfametoxazol
S
S
S
S
S
Penicilina
R
R
R
R
R
Oxacilina
R
R
R
R
R
Rifampicina
S
S
S
S
S
Minociclina
S
S
S
S
S
Cloranfenicol
S
S
S
S
S
Levofloxacina
S
R
S
S
S
Gentamicina
S
R
S
S
S
Norfloxacina
R
R
R
R
R
8
Ampicilina
R
R
R
R
R
Sa: Staphylococcus aureus; UME1: Staphylococcus aureus UME1. R: resistente; S: sensible
Tabla 2: Perfil de resistencia antimicrobiana de los aislamientos clínicos de Escherichia coli.
Ec1785
Ec1763
Ec4905
Meropenem
S
S
S
Ciprofloxacina
R
R
R
Piperacilina/Tazobactama
S
S
S
Cefepime
S
S
S
Amicacina
S
S
S
Ampicilina
R
R
R
Gentamicina
R
R
R
Norfloxacina
R
R
R
Ec: Escherichia coli. R: resistente; S: sensible
Cinco mililitros de solución fisiológica estéril fueron inoculados con 100 µL a
200 µL de la suspensión de las cepas activas, hasta alcanzar una densidad óptica
equivalente a 0,5 de McFarland (1,5x10
8
células por mililitro). Se agregó 0,1 mL de
estas suspensiones bacterianas a 5 mL de caldo MH (Mueller-Hinton) estéril, ajustados
previamente con los cationes: 10 µL Ca
++
y 5 µL Mg
++
, para alcanzar valores que se
aproximan a las concentraciones fisiológicas (Stephen et al., 2005). En cada pocillo de
la policubeta se depositó 3 µL de solución del agente antimicrobiano y 100 µL del caldo
MH inoculado con la cepa contra la que se ensayaría la acción antimicrobiana. Las
policubetas empleadas en los ensayos se incubaron durante 16-20 h a 37° C. Luego de
la incubación, se evidenció el crecimiento bacteriano por la presencia de turbidez y/o un
sedimento de células en el fondo del pocillo. La CIM correspondió a la concentración
más baja de nisina o antibiótico que restringió el crecimiento bacteriano a un nivel
visualmente no evidenciable.
2.5. Evaluación de los efectos de interacción entre las sustancias antimicrobianas
Para la evaluación del sinergismo antibacteriano se utilizó el método del
tablero de ajedrez (Moody, 2007). Se evaluaron diferentes combinaciones de nisina con
antibióticos comerciales: oxacilina, ampicilina, gentamicina y norfloxacina. Cada una
9
de las combinaciones fueron transferidas a un pocillo de una policubeta. Las
concentraciones evaluadas en las combinaciones estuvieron comprendidas en un rango
de una dilución inferior a la CIM, la CIM y el doble de la CIM (para evaluar potencial
antagonismo) de cada uno de los compuestos presentes en la mezcla. Para las bacterias
resistentes a la nisina se probó la concentración 500 µg/mL de la misma, y dos
diluciones siguientes. En cada pocillo se adicionó 100 µl del inóculo bacteriano
conteniendo 5 x 10
5
UFC/ml. Se utilizaron las mismas bacterias que se emplearon para
la determinación de la CIM de los compuestos usados individualmente. Luego se
calcularon los Índices de Concentración Fraccionaria Inhibitoria (ICFI). Para este índice
inicialmente se obtuvieron las Concentraciones Fraccionarias Inhibitorias (CFI) de cada
componente dividiendo la CIM del compuesto en la combinación por la CIM del agente
antimicrobiano solo. El ICFI se calculó luego como la suma de las CFI de cada
componente en la combinación y permitió definir si una mezcla presentaba efecto
sinérgico (≤0,50), aditivo (0,51–1,00), indiferente (1,01–3,99) o antagónico (≥4,00)
(Schelz et al., 2006).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Aislamiento y purificación de bacterias ácido lácticas
De las frutas nativas procesadas, se seleccionaron aleatoriamente 64 colonias
de las placas de agar MRS, según las diferencias en su apariencia morfológica (tamaño,
borde, color y topografía, entre otros). De las cuales, 15 se precaracterizaron como BL
por ser Gram positivas, catalasa negativas, no esporuladas ni móviles (Bergey´s
Manual) (Tabla 3). Estos aislados se seleccionaron, conservaron y utilizaron para las
siguientes pruebas screening para actividad antimicrobiana y caracterización de los
compuestos antibacterianos.
10
Tabla 3: Bacterias aisladas de diferentes frutas nativas procesadas.
BL
Morfología
Fuente
Alg1
Bacilo
Algarrobo
Alg2
Bacilo
Algarrobo
Cha1
Coco
Chañar
Cha2
Coco
Chañar
Cha3
Coco
Chañar
Tun1
Coco
Tuna
Tun2
Coco
Tuna
Tun3
Coco
Tuna
Tun4
Bacilo
Tuna
Tun5
Coco
Tuna
Tun6
Coco
Tuna
Tun7
Coco
Tuna
Tun8
Coco
Tuna
Tut1
Bacilo
Tutiá
Tut2
Coco
Tutiá
Alg: Algarrobo blanco, Cha: Chañar, Tut: Tutiá, Tun: Tuna
3.2. Actividad antimicrobiana
3.2.1. Screening para actividad antimicrobiana
Las suspensiones celulares de los 15 aislados (presuntas BL) mostraron
actividad antagonista contra todos los MI ensayados, independientemente de si se
trataba de bacterias Gram-negativas o Gram-positivas. Presentando, en todos los casos,
halos de inhibición en el rango de 8 a 15 mm. Existen numerosas investigaciones en las
que se registra la actividad antimicrobiana de las BL (aisladas a partir de diversas
fuentes) frente tanto a bacterias Gram-positivas como a bacterias Gram-negativas
(Dejene et al., 2021), siendo S. aureus (Christensen et al., 2021; Spacova et al., 2020) y
E. coli (Byakika et al., 2019; Manzoor et al., 2016) las más estudiadas de cada grupo,
respectivamente. Se tiene conocimiento de que la inhibición que las BL producen sobre
el crecimiento de otras bacterias se debe a múltiples factores, siendo los más
11
importantes la acidificación del medio provocada por la producción de determinados
ácidos orgánicos (principalmente ácido láctico), la coagregación y la producción de
péptidos y proteínas con actividad antimicrobiana (bacteriocinas y sustancias
inhibitorias de tipo bacteriocina) (Agriopoulou et al., 2020; Christensen et al., 2021).
3.2.2. Caracterización de los compuestos antibacterianos
Se observaron áreas de inhibición, de diámetro variable, alrededor de todos los
pocillos inoculados con suspensiones celulares y los correspondientes sobrenadantes
libres de células sin neutralización. Esto último descarta cualquier compuesto unido a la
pared celular de las BL como agente responsable de la inhibición. Por el contrario, no se
observaron halos de inhibición en ningún pocillo donde se sembró sobrenadante libre de
células neutralizado, lo que indica que la inhibición reportada por las diferentes
bacterias aisladas frente a los MI estudiados se debe a la producción de ácido. Esto
elimina la producción de peróxidos o la síntesis de compuestos tipo bacteriocinas de la
lista de potenciales agentes antagonistas del crecimiento de los MI. Hwanhlem et al.
(2014), aislaron 386 BL a partir de material vegetal fresco, de los cuales sólo 4 cepas
fueron capaces de producir compuestos de tipo bacteriocina e inhibir a Brochothrix
thermosphacta DSM 20170 y L. monocytogenes DMST 17303 en ensayos de difusión
en agar. Otros autores como Demir & Basbülbül (2017), aislaron más de cien BL, todas
mostraron actividad antimicrobiana frente a E. coli, L. monocytogenes y L. innocua
debido a la producción de ácido. En otro estudio, Grosu-Tudor et al. (2014) aislaron 274
cepas de BL de alimentos fermentados tradicionales de Rumania y solo alrededor del
2% de ellas fueron capaces de producir compuestos inhibidores de tipo bacteriocina. Por
su parte, Elyas et al. (2015), aislaron 40 cepas BL de vegetales fermentados típicos de
Sudán y encontraron que 2 de ellas producían sustancias del tipo bacteriocinas. Estos y
otros estudios realizados por diversos autores destacan la notable dificultad que supone
el aislamiento de BL productoras de bacteriocinas.
Cabe resaltar, además, que las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-
positivas tienen un desempeño pobre como agentes antibacterianos frente a Gran-
negativas debido a la presencia de la membrana externa, la cual constituye una barrera
que controla eficazmente la permeabilidad a este tipo de sustancias; por lo que la
actividad antagonista de las BL sobre este tipo de bacterias parece deberse casi en su
12
totalidad a la acción del ácido láctico. Este ácido orgánico es una molécula pequeña,
soluble en agua, que puede permear al espacio periplasmático a través de proteínas
porinas y atravesar la membrana citoplasmática en su forma no disociada, induciendo la
caída del pH intracelular y la consecuente alteración de la fuerza protón-motriz
transmembranal (Agriopoulou et al., 2020
3.3. Determinación del perfil antimicrobiano frente a patógenos clínicos
Debido a que, hasta el momento, no se logró aislar y seleccionar una BL cuya
producción de bacteriocina fuera suficiente y prometedora para su potencial aplicación;
tal lo planificado, se continuaron los estudios con nisina comercial de Lactococcus
lactis Sigma-Aldrich® (potencia: 900 UI/mg) en las siguientes pruebas.
Se determinó que la CIM de nisina frente a 8 estáfilos (3 cepas ATCC y 5
cepas SARM obtenidas de aislamientos clínicos) estuvo comprendida entre 250-500
µg/mL (Tabla 4). Además, se estudió la CIM de oxacilina y gentamicina frente a las
cepas de aislamientos clínicos a fin de valorar y/o corroborar el carácter de
susceptibilidad/resistencia a dichos antibióticos, encontrándose que las cepas UME1,
Sa5307, Sa5646 y Sa5627 presentaron resistencia frente a la oxacilina (CIM ≥ 4 µg/mL)
y que ninguna de las cepas de aislamientos clínicos resultó resistente a la gentamicina
(CIM ≥ 16 µg/mL).
Cabe destacar que la elección de los antibióticos y los criterios para determinar
resistencia o susceptibilidad a los mismos, fueron escogidos siguiendo las
recomendaciones presentes en Clinical and Laboratory Standards Institute (2020).
Tabla 4: Determinación de CIM de agentes antibacterianos frente a cepas de estafilococos.
Cepas bacterianas
CIM
Nisina
CIM
Oxacilina
CIM
Gentamicina
Sa29213
250
0.125
0.25
Sa25923
500
0.125
0.25
Se
500
8
2
UME1
500
9
9
Sa5307
500
9
9
Sa5357
500
<0,6
4,5
Sa5646
500
300
75
13
Sa5627
500
18
9.37
Sa: Staphylococcus aureus; Se: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; UME1:
Staphylococcus aureus “UME1”; S: sensible. Las concentraciones de CIM están expresadas en
µg/mL.
Adicionalmente, se determinó las concentraciones inhibitorias mínimas de
nisina, gentamicina, norfloxacina y ampicilina frente a cepas de Escherichia coli (Tabla
5). Las cuatro cepas de E. coli evaluadas fueron resistentes a la gentamicina (CIM ≥ 16
µg/mL). Las cepas Ec4905, Ec1785 y Ec1763 fueron resistentes a ampicilina (CIM ≥ 32
µg/mL) y a norfloxacina (CIM ≥ 16 µg/mL). No se encontró CIM de nisina frente a
ninguna de las cepas de E. coli; por lo que se supone que, de existir esta, se encuentra
por encima de la dosis máxima ensayada.
Tabla 5: Determinación de CIM de agentes antibacterianos frente a cepas de Escherichia coli.
Cepas bacterianas
CIM
Nisina
CIM
Gentamicina
CIM
Norfloxacina
CIM
Ampicilina
Ec35218
>1000
18
<9
<9
Ec4905
>1000
75
150
>300
Ec1785
>1000
37,5
300
>300
Ec1763
>1000
75
>300
300
Ec: Escherichia coli. Las concentraciones de CIM están expresadas en µg/mL.
Los resultados hallados son coherentes con los obtenidos por otros
investigadores que estudiaron la capacidad antibacteriana y el espectro de actividad de
la nisina, respecto a la actividad frente a bacterias gran positivas. Por ejemplo, Shi et al.
(2017), demostraron que la nisina es capaz de inhibir el crecimiento de 14 cepas de S.
aureus, con CIM oscilando entre 16 y 32 µg/mL. Por su parte, Jensen et al. (2020),
determinaron la CIM de nisina frente a cepas SARM, obteniendo valores entre 6,4 y
12,8 µg/mL; además de comprobar que la nisina exhibió actividad bactericida frente a
estas cepas y que la resistencia a la meticilina no modifica la sensibilidad a la nisina.
Yehia et al. (2022) comprobaron el efecto bacteriostático de la nisina sobre cepas
SARM. Adicionalmente, Bennett et al. (2021), evaluaron la actividad antibacteriana de
varias bacteriocinas (incluida la nisina) frente a cepas multirresistentes de S. aureus y
Streptococcus, encontrando que 14 de estas cepas multirresistentes fueron inhibidas por
14
nisina, con una CIM que fue menor o igual a 100 µg/mL, concentraciones menores a las
registradas en nuestro estudio. Nuestros resultados indicarían que las MI utilizadas
presentan mayor resistencia a la nisina en las condiciones ensayadas.
Se tiene conocimiento de que el espectro de actividad de la nisina está
prácticamente restringido a una amplia variedad de bacterias Gram-positivas (incluidas
bacterias formadoras de esporas y bacterias patógenas y responsables de
descomposición), exhibiendo escasa o nula actividad frente a bacterias Gram-negativas,
levaduras y mohos (Moshtaghi et al., 2018). Esto no hace más que respaldar los
resultados hallados en el presente estudio. Esta falta de actividad de la nisina frente a
bacterias Gram-negativas se debe a la membrana externa, que actúa como barrera de
permeabilidad, impidiendo la interacción entre la nisina y el lípido II y, en
consecuencia, neutralizando la actividad antibacteriana de la misma (Jensen et al.,
2020).
A raíz de la dificultad que interpone al accionar de la nisina la membrana
celular de las bacterias Gram-negativas, diversas estrategias han sido estudiadas para
intentar superar dicho obstáculo, entre las que figuran la adición de agentes quelantes
(EDTA, lactoferrina, citratos, etc.), el uso de liposomas y el desarrollo de
nanocompuestos unidos a nisina, entre otros (Khan et al., 2015; Vukomanović et al.,
2017). La idea principal detrás de estas estrategias es la de alterar la integridad de la
membrana externa.
3.4. Evaluación del tipo de interacción entre antibióticos y nisina
En la Tabla 6 podemos observar que se halló interacción de tipo sinérgica
(ICFI≤0,50) de nisina y oxacilina frente a tres cepas distintas de SARM: Sa5646, UME1
y Sa5307 y efecto aditivo (ICFI= 0,51-1,00) al ser ensayada contra Sa5627.
Mientras que las combinaciones de nisina y gentamicina resultaron indiferentes
(ICFI 1,01-3,99) al ser ensayadas contra las cepas de S. aureus. Lo mismo resultó
(efecto indiferente) al combinar gentamicina, norfloxacina, y ampicilina con Nnisina al
ser evaluadas contra las cepas de E. coli estudiadas.
Tabla 6: Evaluación de la interacción entre nisina y oxacilina frente a cepas de S. aureus.
Cepas bacterianas
CFI
Nisina
CFI
Oxacilina
ICFI
Tipo de interacción
15
Sa5646
0,25
0,25
0,5
sinergismo
Sa5627
0,5
0,125
0,625
aditividad
UME1
0,25
0,125
0,375
sinergismo
Sa5307
0,25
0,25
0,5
sinergismo
CFI: concentración fraccionaria inhibitoria; ICFI: índice de concentración fraccionaria
inhibitoria. ICFI: ≤0,50 efecto sinérgico; 0,51–1,00 efecto aditivo; 1,01–3,99 efecto indiferente;
≥4,00 antagonismo. Las concentraciones están expresadas en µg/mL.
En lo que concierne al efecto de combinaciones de antibióticos (u otros agentes
con actividad antimicrobiana) y nisina frente a bacterias Gram-positivas, hay una
cuantiosa diversidad de estudios en los que se verifica el efecto sinérgico de dichas
combinaciones, principalmente frente a estafilococos. Por ejemplo, Yehia et al. (2022),
encontraron una combinación sinérgica entre nisina y reuterina (compuesto orgánico
producido por Lactobacillus reuteri) al ser evaluada contra una cepa SARM y S. aureus
ATCC 25937. Existen, además, investigaciones que demuestran la actividad sinérgica
en combinaciones de nisina con eritromicina y con cefazolina, frente a una cepa de
Streptococcus del grupo B (procedente de un aislamiento clínico) y bacterias patógenas
causantes de mastitis, respectivamente (Kitazaki et al., 2017; Hayes et al., 2019). Un
estudio de Wang et al. (2023) fue llevado a cabo con la finalidad de evaluar la actividad
(in vivo e in vitro) y los potenciales mecanismos de acción de combinaciones de nisina y
oxacilina frente a cepas SARM. En dicha investigación los autores demostraron que la
nisina puede restaurar la susceptibilidad de las cepas SARM a la oxacilina (e inhibir la
producción de biofilms) al inhibir la transcripción del gen mecA (responsable de la
resistencia a la meticilina).
En relación a la actividad antimicrobiana de la nisina frente a bacterias Gram-
negativas, como ya se discutió en el apartado anterior (3.3), se tiene conocimiento del
escaso efecto que esta tiene sobre estos microorganismos, por lo que los resultados
hallados en los experimentos de interacción entre nisina y antibióticos frente a cepas de
E. coli resistentes no resultan sorpresivos. Esto quizás se deba a que las concentraciones
de nisina evaluadas no alcanzaron a ejercer un efecto desestabilizador considerable
sobre la membrana externa de la pared celular bacteriana como para alterar su
16
integridad, condicionados por la concentración de nisina comercial con la que se trabajó
(Jensen et al., 2020; Khan et al., 2015; Vukomanović et al., 2017).
4. CONCLUSIONES
Valorar la biodiversidad local de la provincia de Chaco y la búsqueda de BL
productoras de bacteriocinas subraya la importancia de explorar los recursos naturales
autóctonos. Aunque en esta investigación no se logró aislar cepas productoras de
bacteriocinas, el estudio proporciona una base valiosa para futuros trabajos que podrían
considerar la utilización de diferentes fuentes, sumando productos vegetales
fermentados, repetir los ensayos en temporadas con más precipitaciones y con más
producción de frutos, o métodos de aislamiento más avanzados.
Los resultados obtenidos demostraron que la nisina comercial exhibe un
espectro de acción limitado, mostrando una aceptable actividad antimicrobiana contra
bacterias Gram-positivas. No se observó inhibición significativa del crecimiento de
bacterias Gram-negativas (todas ellas cepas de Escherichia coli), lo que resalta la
limitación de la nisina frente a estos tipos de microorganismos. Este hallazgo es
consistente con la literatura revisada, que sugiere que la nisina, debido a su mecanismo
de acción enfocado principalmente en la pared celular bacteriana, es menos efectiva
contra bacterias Gram-negativas que poseen una membrana externa adicional que actúa
como una barrera protectora.
Adicionalmente, se evaluó el tipo de interacción desarrollada entre la nisina y
los antibióticos: oxacilina, gentamicina, norfloxacina y ampicilina, frente a bacterias
resistentes a antibióticos. Los resultados mostraron que la nisina no presentó interacción
sinérgica o aditiva con los antibióticos al ser evaluada frente a bacterias Gram-
negativas, lo cual limita su potencial aplicación frente a este tipo de patógenos. En
contraste, cabe resaltar que, se halló 3 combinaciones de nisina y oxacilina con
comportamiento sinérgico, y una con comportamiento aditivo, capaces de inhibir
eficientemente el crecimiento de 4 cepas SARM.
En conclusión, esta investigación ofrece información valiosa sobre las
limitaciones y potencialidades de la nisina en el contexto del desarrollo de nuevas
estrategias y combinaciones de agentes antimicrobianos tendientes a la lucha contra la
problemática emergente de la resistencia bacteriana a los antibióticos. Los resultados
17
sugieren que, aunque la nisina puede ser efectiva contra bacterias Gram-positivas y
podría tener un papel en tratamientos específicos combinados, carece de eficacia contra
bacterias Gram-negativas. Estos hallazgos enfatizan la necesidad de continuar
explorando nuevas fuentes de aislamiento y tipos de bacteriocinas, así como de
desarrollar estrategias innovadoras que puedan superar las barreras presentadas por las
bacterias Gram-negativas. Por otro lado, queda pendiente el estudio de interacción entre
nisina y otros ATB comerciales. La integración de estos conocimientos es crucial para
avanzar en la lucha contra la resistencia antimicrobiana y mejorar el manejo de
infecciones bacterianas.
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